使用石英微针进行啮齿类动物脑部微注射

摘要

来源：Paolone, G., 等．用于啮齿类动物脑部微量注射的个性化针头．J. Vis. Exp．（2018）

本视频演示了使用带孔石英微针进行啮齿类动物脑部微针注射的方法。微针连接至注射器和微泵，以控制给药速率。将含有注射溶液的针头以较低的推进速度插入脑内。到位后，提高给药速度。短暂停留后，将针头撤出。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 石英针的制备

1. 将石英毛细管（见材料表）依次置于蒸馏水中5分钟、99%乙醇中5分钟以及二乙醚中5分钟，以进行清洁和灭菌。
2. 将毛细管置于通风橱中至少1小时，使其完全干燥。
3. 使用激光拉针仪根据具体需求设定参数，制备针头，确保所制得的针头足够长且足够细。
   注意：我们使用激光拉针仪（见材料表），采用双阶段程序进行拉制。第一阶段使用高功率、最大扫描长度（对应“FILAMENT'S VALUE”）且不施加拉力。该参数组合可使毛细管大部分区域熔化并以最低延伸速度成形，从而获得具有较大内外径、较短针柄且长度足够的针头，同时保持较高的机械强度和较大的内径，有利于干细胞或病毒颗粒顺利通过而不堵塞。此阶段的延伸速度和延迟时间应设置为在针尖变得过细或过长之前停止延伸，以避免失去所需的机械性能和形态特征。第二阶段程序在石英冷却后（约5秒）自动执行，其功率、灯丝值和拉力参数应设置为能够切割出尽可能短的针尖和陡峭的针柄，同时避免两根针头在分离时发生针尖断裂。常规情况下，使用我们的设备时参数设置如下：(a) 第一阶段 = 功率990，灯丝值5，速度130，延迟110，拉力0；(b) 第二阶段 = 功率970，灯丝值3，速度0，延迟70，拉力0。
4. 将制好的针头放入先前用70%乙醇清洁过的培养皿中。
   1. 用塑料封口膜覆盖培养皿。
5. 使用显微切割仪对毛细管进行切割。
   1. 启动时，让激光自动执行自校准程序，以确认输出的功率和能量。随后设定切割参数。
      注意：我们使用显微切割仪（见材料表），参数设置如下：激光脉冲能量为63 µJ，激光束直径为最大孔径的20%（最大孔径：1.0 µm），切割速度为最大速度的10%（最大速度：30 µm/s）。
   2. 将针头牢固固定在显微镜载物台上，并将其尖端置于电脑屏幕中央。
   3. 在菜单栏中点击铅笔图标，并用其在屏幕上绘制标记，用于指示激光切割位置。
      注意：切割角度应与针头表面成约45°。
   4. 在侧边功能栏中选择包含“START CUT”按钮的标志，以启动激光对已标记位置的切割。
   5. 如需制作侧孔，可重复步骤1.5.2–1.5.3的操作；无需重新定位针头（图1）。
6. 切割后清洗。
   1. 通过塑料管将针头连接至空泵。
   2. 开启泵，并手动将正向流速调节至中等速度（3 µL/min）。
   3. 先吸入99%乙醇，再吸入蒸馏水，以去除切割过程中产生的杂质。
   4. 再次吸入99%乙醇，以便后续干燥。
      注意：每个步骤应持续至少3分钟。
7. 将针头存放于加盖妥当的培养皿中，直至手术当日使用。
8. 针头可重复使用；实验结束后，用次氯酸钠溶液和乙醇清洗，以去除残留液体和可能的组织残留物。如需更彻底清洗，可将针头放入微量移液器储存罐中，针尖朝下，加入蒸馏水至完全浸没针尖，煮沸1.5分钟以清除残留组织，随后用乙醇冲洗。

2. 实验步骤

1. 根据泵用户手册中的说明，选择设置菜单，根据显微注射器的直径/体积校准泵，并将流速设定为0.3 µL/min
2. 使用带有钝头针（例如 Hamilton 针，30 G）和短聚四氟乙烯管的 10 mL 注射器吸取无菌水，将其充满后，用于填充显微注射器（在非常小心地取出活塞后）以及手动显微注射泵（MMP）的注射组件套件。
   注意： MMP试剂盒用于在立体定位仪框架中安全固定针头（图2该试剂盒包含聚四氟乙烯管、鲁尔接头转管路连接器、移液器支架，以及适用于不同外径移液器的垫圈。
3. 将针头连接到MMP试剂盒。
   1. 通过10 mL注射器向系统中注入更多水，检查水是否从针头流出。
      注意： 重复填充步骤，确保去除系统内部的气泡。
4. 将10 mL注射器从显微注射器上取下，同时缓慢推动活塞，使显微注射器顶端留下一滴水。将活塞插入显微注射器中。
5. 将显微注射器连接至泵，并将流速设定为 0.3 µL/min
   注意： 等待针尖出现液滴渗出，然后继续静置3分钟。
6. 将流速设为 0.1 µL/min，并开始手术操作。手术过程中应保持泵的运行。
   注意： 本文所报告的实验使用体重为300 g（3月龄）的雄性Sprague Dawley大鼠。然而，该操作步骤同样适用于其他物种，尤其是小鼠。
7. 使用当地法规批准的方法诱导全身麻醉。
   注意： 我们采用腹腔注射（i.p.）85 mg/kg 氯胺酮和 8 mg/kg 噻拉嗪的混合制剂，以实现 20–50 分钟的麻醉效果。必须通过尾部和/或脚趾夹捏反应确认动物已完全镇静。在手术开始前评估麻醉深度及基本生命体征，并在手术过程中每 10 分钟监测一次。手术前后及手术期间，均使用循环水加热垫维持动物体温恒定。动物需持续监测直至完全恢复（例如能够直立并自由活动）。此外，术后每天腹腔注射镇痛药（曲马多，5–7 mg/kg）一次，连续给药三天。
   1. 剃除动物头部的毛发，并充分准备手术区域以进行无菌手术。使用含碘溶液（如聚维酮碘）进行两步法擦洗，随后使用70%乙醇。此外，为维持无菌状态，应用手术巾包裹手术区域（视频中为便于演示已省略此步骤）。
8. 将大鼠置于立体定位仪框架内，下方垫上循环水加热毯。为提供额外的镇痛效果，于手术部位局部应用0.5%利多卡因溶液（剂量不超过7 mg/kg）。使用玻璃珠灭菌器或液体冷消毒法对所有手术器械进行预灭菌处理：将器械浸入含2%戊二醛和7.05%苯酚的溶液（如Sporodicin或Cidex）中，随后用无菌水或生理盐水冲洗。即使在连续操作之间也必须执行消毒程序。使用已灭菌的手术刀在颅骨表面做纵向切口，操作轻柔以避免过度出血。用扁平刮刀分离头皮，并在皮肤瓣上夹上手术夹以保持切口开放。极其轻柔地剥离骨膜，暴露前囟点及针头将穿刺的颅骨区域。
9. 将手臂固定在立体定位仪框架上（在持续灌流的同时），移动针尖至前囟点正上方，注意避免损坏针尖。记录前囟点的前后向和内外向坐标，并转换至目标坐标的相应位置。在体视显微镜引导下，缓慢降低针头直至其尖端接近颅骨表面，随后略微抬高立体定位臂，标记钻孔位置。
10. 钻头（钻头尖端） Ø：0.8 mm；钻速：1,000 rpm）在标记位置钻开颅骨。钻孔过程中须注意避免穿透硬脑膜。钻孔时应滴加无菌生理盐水，以防止骨组织损伤和坏死。
11. 剪下一小块塑料石蜡膜，覆盖在颅骨上。使用10 µ用L型移液器在塑料石蜡膜上滴加一滴待注射溶液。停止泵送，轻微回拉泵的推杆，并通过轻轻拉动显微注射器的活塞在毛细管中形成一个小气泡。
12. 降低立体定位臂，直至针尖接触液滴。通过缓慢抽动微量注射器的活塞吸取样品，避免产生气泡。将泵的推杆重新与活塞接触，开启泵并设置流速为0.3 µ升/分钟。继续等待数分钟，直至液滴形成后再进行下一步操作。
    注意： 在本示例实验中，人工脑脊液（aCSF）被注入纹状体 [前后位（AP）：+1.5，内外侧位（ML）： ±2.7；背腹向（DV）：-5.0] 以及背侧海马（前后向（AP）：-3.5，内侧向外侧（ML）： ±2.1；DV：-3.5；单位为 mm（自硬脑膜起） µL/位点。为了便于比较两种注射方法，每个脑区在半球一侧使用石英针注射，而在另一侧则使用26 G钝头或30 G斜尖不锈钢针注射。
13. 将流速降低至 0.1 µL/min，使用不锈钢斜面针尖刺破硬脑膜，沿背腹轴缓慢降低立体定位臂，进入脑组织。到达目标位置后，再下降0.1 mm，停止泵送，将立体定位臂抬高0.1 mm，然后以0.3 L/min的流速重新启动泵 µL/min
    注意： 在降低针头时保持缓慢流速的原因是确保正压，以避免微小组织碎片进入针头内部。此类情况会堵塞针尖，影响溶液的输送。由于在降低针头过程中流速非常缓慢，且下降速度约为10秒/毫米，这意味着沿针道残留的溶液量与在靶部位注射的溶液量相比可忽略不计。当使用带有侧孔的针头时，此预防措施可省略。
14. 启动计时器，并根据所需注射体积等待相应时间（例如，若注射 2 µL）。注射时监测气泡的移动。结束时停止泵送，等待5分钟后缓慢拔出针头。当石英针完全抽出后，重新启动泵，检查针尖是否形成液滴。
15. 用骨蜡封闭颅骨表面的开口，移除止血夹，缝合头皮，于伤口周围涂抹抗生素软膏（如新霉素），然后将动物放回饲养笼中。

结果

图1：石英针尖的显微图像，显示用于液体注射的针尖和孔洞的不同直径。 （A）为低倍图像，（B）和（C）为高倍图像。根据脑区解剖结构、扩散目标以及溶液黏度，可采用不同方式制备针头（不同的长度、孔数和孔径尺寸），如（B）和（C）所示。注意使用低功率激光显微切割技术所获得的孔洞和针尖的平滑切口。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石英毛细管	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	无纤维丝
拉针仪	Sutter	P2000
微量移液器储存罐	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
激光显微切割系统	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
哈密尔顿注射器	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany	19138-U
微注射泵	Univentor, Zejtun, Malta	Model 864
手动微注射泵套件	WPI	Item#: MMP-KIT	可将微量移液器牢固安装至立体定位仪的套件
精密钻孔机	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	带变频调速的球轴承驱动轴
人工脑脊液	Tocris	3525
26G钝头针和30G斜面针	Hamilton	26 G Blunt: 19138-U30 G Bevel: 20757