靶向siRNA递送至神经元以沉默朊蛋白的脂质体复合物应用

摘要

来源：Bender, H. R., et.al. 利用阳离子与阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用脂质体siRNA-肽复合物（LSPCs）将朊蛋白（PrP）siRNA靶向递送至神经元的方法。带正电荷的脂质体通过静电作用结合靶向PrP的siRNA，并进一步由RVG-9r肽稳定，从而介导其经受体转运穿越血脑屏障。进入大脑后，LSPCs在神经元中经历内吞作用，释放siRNA以启动RNA干扰，降低PrP的表达水平，阻断朊病毒疾病的进展。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. LSPCs 的制备

1. 使用1:1的DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）: 胆固醇比例制备LSPC。制备4 nmol脂质体时，将2 nmol DOTAP和2 nmol胆固醇溶于10 ml体积比为1:1的氯仿:甲醇溶液中，置于烧瓶内混合。
2. 使用氮气蒸发9毫升氯仿:甲醇溶液₂ 在通风橱中通入气体。在通风橱中过夜蒸发最后1 ml溶剂，不通入气体。观察烧瓶底部形成的薄层脂质膜。
3. 将10 ml 10%的蔗糖溶液加热至55 °C。
4. 将加热的10%蔗糖溶液缓慢倾注于薄层脂膜上 即 1 ml/min，同时轻轻摇动烧瓶。将10%蔗糖溶液和含脂质的烧瓶维持在55 °C，以确保脂质分子保持在凝胶-液体相。水合过程将形成多层囊泡（MLV）。
5. 在对脂质体进行粒径均一化处理前，于55 °C下使脂质充分水化至少1小时。
6. 按照制造商的说明组装挤出器，并使用1.0 µm滤膜进行粒径控制，或直接使用1.0 µm的一次性注射器滤器进行过滤。
7. 将1 ml加热的脂质体悬液加入挤出器的一个注射器中，使悬液在两个注射器之间来回通过11次。确保经过11次挤出后，悬液位于与起始注射器相对的另一注射器中。
8. 通过0.45 µm滤器后，再经0.2 µm滤器对脂质体进行再次挤出，以制备大单室脂质体（LUVs）。保持脂质体悬液处于加热状态，以利于挤出过程。
9. 将20 µl的4 nmol脂质体悬液（200 µM）与200 µl的20 µM（共4 nmol）siRNA储备液在室温下孵育10分钟。
10. 将80 µl的500 µM（总共40 nmole）RVG-9r储备液与siRNA/脂质体溶液在室温下孵育10分钟。LSPCs应尽快使用，但也可在制备后数小时内使用。制备后的LSPCs可在4 °C保存数小时。

2. 向小鼠注射LSPCs

1. 将小鼠暴露于热灯下 5-10 分钟，以扩张血管系统。
2. 在注射前 5-10 分钟及注射过程中，使用 2-3% 异氟烷/氧气气流对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉状态：当动物不再活动且呼吸变慢时，表明已进入麻醉状态。将小鼠仰卧或侧卧，以便接触尾静脉。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹小鼠眼睛，防止角膜干燥。
3. 用 70% 乙醇擦拭或喷洒尾部，并使用 26 G 胰岛素注射器将 300 µl LSPCs 注入小鼠尾静脉。从尾部远端开始注射，若静脉塌陷或破裂，则向近端移动继续注射。
4. 将小鼠置于清洁笼中，直至其能够维持胸卧位。在小鼠完全恢复前，不得将其与其他笼内同伴放在一起。小鼠通常在 5 至 15 分钟内恢复。若恢复时间较长，可将其置于加热垫上或热灯下以维持体温，但需密切监测，防止过热。
5. 注射后数小时内持续监测动物，确保麻醉作用完全消退，且治疗未产生不良反应。让 LSPCs 在体内循环至少 24 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DOTAP 脂质	Avanti Lipids	890890
胆固醇	Avanti Lipids	700000
氯仿	Fisher Scientific	AC268320010
甲醇	EMD Millipore	113351
N₂ 气体	AirGas
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500
挤出器	Avanti Lipids	610023
1.0、0.4 和 0.2 μm 滤膜	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006