用于神经治疗应用的基因工程间充质干细胞的表征

摘要

来源：Sharma, A. D., et.al. 用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞的高通量表征。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了对经基因工程改造以表达治疗性神经营养因子的转基因间充质干细胞进行表征的过程。视频概述了固定、通透以及使用靶向细胞增殖标志物的一抗和二抗对细胞染色的步骤，随后通过高内涵筛选系统分析细胞核中的荧光信号。增殖标志物表达水平的升高证实了该转基因细胞适用于神经治疗领域。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. Ki67 细胞增殖检测

1. Ki67 细胞增殖检测（免疫细胞化学）
   1. 用 0.1 M 磷酸盐（PO₄）缓冲液冲洗细胞培养物，每次 1 分钟，共两次。在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定培养物 20 分钟。去除 PFA，并用 PBS 冲洗孔板，每次 7 分钟，共三次。
   2. 最后一次冲洗后，向每孔加入 100 µl 封闭液（磷酸盐缓冲液、5% 正常驴血清、0.4% 牛血清白蛋白和 0.2% Triton X-100），在室温下孵育 1 小时。将一抗（兔抗 Ki67 抗体）用封闭液按 1:200 的工作比例稀释后备用。
   3. 去除封闭液，向每孔加入 100 µl 一抗溶液。盖好 96 孔板，在 4 °C 下过夜孵育。
   4. 次日，去除抗体溶液，用 PBS 冲洗 7 分钟，重复三次。
   5. 将二抗（驴抗兔 Cy3）用封闭液按 1:500 的工作比例稀释，并在二抗溶液中加入 DAPI 核染料，稀释比例为 1:100。最后一次 PBS 冲洗后，向每孔加入 100 µl 二抗/DAPI 混合溶液。在避光条件下室温孵育 90 分钟。
   6. 去除二抗/DAPI 溶液，用 PBS 冲洗每孔 7 分钟，共三次。盖好 96 孔板，于 4 °C 保存，待成像时使用。

2. 自动化成像与多波长评分分析

1. 将已进行 Ki67 免疫标记处理的 96 孔板载入 HCS 系统，静置平衡 20 分钟。打开 HCS 系统的图像采集与分析软件。
2. 选择 10X 物镜的采集参数，相机二进制合并（binning）设为 1，增益（gain）设为 2。利用自动曝光功能确定细胞所在的 Z 平面，并计算每个目标波长的偏移量。本分析中采集 DAPI（W1）和 Cy3（W2）的图像。选择在阴性对照孔无信号时的最大强度水平进行图像采集，并确认该设置适用于阳性孔。
3. 采集整块板的图像，并将其存储至图像采集与分析软件的数据库中。
4. 图像采集完成后，打开 HCS 系统的离线图像分析软件，查看上述采集图像的板数据。
5. 选择多波长评分分析模式，为每个波长设置最小和最大强度。
   注意：DAPI 检测应标记每个可见细胞核周围的染色区域。Cy3 应检测出具有 Ki67 免疫反应性（IR）的阳性细胞，而在阴性对照条件下不应出现免疫反应信号。对于 Cy3 标记的 Ki67 免疫反应性，其近似最小宽度为 7 µm，近似最大宽度为 30 µm，信号强度高于局部背景 150 灰度级，最小染色面积为 50 µm²。
6. 对所有位置运行分析，将数据导出以便在电子表格中查看。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Greiner Bio One	655090	用于 ImageXpress 的 96 孔板
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	A9647
兔抗Ki67抗体	Abcam（马萨诸塞州剑桥市）	Ab16667	1:200 稀释度
DAPI	Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）	D3571
驴抗兔Cy3	杰克逊免疫研究实验室（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）	711-165-152	1:500 稀释度
成年C57BL/6小鼠的间充质干细胞	杜兰基因治疗中心（路易斯安那州，新奥尔良）		骨髓分离
基因修饰的MSCs（GFP、BDNF、GDNF、BDNF/GDNF）	这些细胞来自我们之前的研究：Ye 等（待发表）
正常驴血清（NDS）	杰克逊免疫研究实验室（美国宾夕法尼亚州西格罗夫）	017-000-121
多聚甲醛（PFA）	Fisher Scientific（新罕布什尔州汉普顿）	O4042	0.1 M 磷酸盐缓冲液中的 4% PFA
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	P4417
Triton X-100	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	X100
ImageXpress Micro	Molecular Devices（美国森尼韦尔）	ImageXpress micro	高内涵筛选系统
MetaXpress 4.0	Molecular Devices（美国森尼韦尔）	MetaXpress 4.0	图像采集与分析软件
KH₂PO₄	Fisher Scientific（新罕布什尔州汉普顿）	P285	用于PO₄缓冲液
K₂HPO₄	Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿）	P288	用于PO₄缓冲液