用于神经治疗应用的基因工程间充质干细胞的表征

Abstract

资料来源：Sharma， AD et.al。为神经保护策略的治疗因子递送而设计的成体干细胞的高通量表征。J. Vis. Exp.（2015年）

该视频演示了表征转基因间充质干细胞的过程，这些干细胞被改造为表达治疗性神经营养因子。它概述了用靶向细胞增殖标志物的一抗和二抗固定、透化和染色细胞所涉及的步骤，然后使用高内涵筛选系统进行分析以捕获细胞核中的荧光信号。增殖标志物表达的增加证实了转基因细胞对神经治疗应用的适用性。

Protocol

所有涉及动物样本的程序都经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. Ki67 细胞增殖测定

1. Ki67 细胞增殖测定（免疫细胞化学）
   1. 用 0.1 M 磷酸盐 （PO₄） 缓冲液冲洗细胞培养物一分钟两次。在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定培养物20分钟。除去PFA并用PBS冲洗孔7分钟3次。
   2. 最后冲洗后，向每个孔中加入100μl阻滞剂溶液（磷酸盐缓冲盐水，5%正常驴血清，0.4%牛白蛋白血清和0.2%Triton X-100），并在室温下孵育1小时。通过在阻断剂溶液中以1：200的工作比例稀释，制备一抗兔抗Ki67。
   3. 取出阻断剂溶液，将 100 μl 一抗溶液应用于每个孔中。盖上 96 孔板并将样品在 4°C 下孵育过夜。
   4. 第二天，取出抗体溶液并用PBS冲洗7分钟，3次。
   制
   5. 备二抗，驴抗兔Cy3在封闭溶液中，工作比例为1：500。将DAPI核染色剂以1：100的稀释度加入二抗溶液中。去除最后一次PBS冲洗后，向每个孔中施用100μl二抗/ DAPI溶液。在室温下在黑暗中孵育90分钟。
   6. 取出二抗/DAPI 溶液并用 PBS 冲洗每个孔 7 分钟，3 次。盖上 96 孔板并储存在 4°C 直至成像。

2. 自动成像和多波长评分分析

1. ：将 96 孔板（先前处理过用于 Ki67 免疫标记）加载到 HCS 系统中，并让板平衡 20 分钟。打开 HCS 系统图像采集和分析软件。
使用
2. 相机合并为 1 和增益设置为 2 来选择 10 倍物镜的采集设置。利用自动曝光功能找到细胞所在的 Z 平面，并计算每个感兴趣波长的偏移量。对于此分析，捕获 DAPI （W1）、Cy3 （W2） 的图像。选择阴性对照孔不显示图像采集信号的最大强度水平。确认此设置适用于正孔。
3. 获取盘子。捕获图像并将其存储在图像采集和分析软件的数据库中。
4. 采集图像后，打开图像采集和分析离线软件，并查看上面采集的图像中的板数据。
5. 选择多波长评分分析。配置每个波长的最小和最大强度。
   注意：DAPI 检测应标记每个可见细胞核周围的染色。Cy3应检测具有Ki67免疫反应性（IR）的阳性细胞，而不应检测阴性对照下的IR。对于Cy3 Ki67 IR，近似最小宽度为7 μm，近似最大宽度为30 μm，局部背景以上的强度为150灰度，最小染色面积为50 μm²。
6. 对所有位置进行分析。导出数据以在电子表格中查看。

Materials