用于神经治疗应用的基因工程间充质干细胞的表征

Abstract

资料来源：Sharma， AD et.al。为神经保护策略的治疗因子递送而设计的成体干细胞的高通量表征。J. Vis. Exp.（2015年）

该视频演示了表征转基因间充质干细胞的过程，这些干细胞被改造为表达治疗性神经营养因子。它概述了用靶向细胞增殖标志物的一抗和二抗固定、透化和染色细胞所涉及的步骤，然后使用高内涵筛选系统进行分析以捕获细胞核中的荧光信号。增殖标志物表达的增加证实了转基因细胞对神经治疗应用的适用性。

Protocol

所有涉及动物样本的程序都经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. Ki67 细胞增殖测定

1. Ki67 细胞增殖测定（免疫细胞化学）
   1. 用 0.1 M 磷酸盐 （PO₄） 缓冲液冲洗细胞培养物一分钟两次。在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定培养物20分钟。除去PFA并用PBS冲洗孔7分钟3次。
   2. 最后冲洗后，向每个孔中加入100μl阻滞剂溶液（磷酸盐缓冲盐水，5%正常驴血清，0.4%牛白蛋白血清和0.2%Triton X-100），并在室温下孵育1小时。通过在阻断剂溶液中以1：200的工作比例稀释，制备一抗兔抗Ki67。
   3. 取出阻断剂溶液，将 100 μl 一抗溶液应用于每个孔中。盖上 96 孔板并将样品在 4°C 下孵育过夜。
   4. 第二天，取出抗体溶液并用PBS冲洗7分钟，3次。
   制
   5. 备二抗，驴抗兔Cy3在封闭溶液中，工作比例为1：500。将DAPI核染色剂以1：100的稀释度加入二抗溶液中。去除最后一次PBS冲洗后，向每个孔中施用100μl二抗/ DAPI溶液。在室温下在黑暗中孵育90分钟。
   6. 取出二抗/DAPI 溶液并用 PBS 冲洗每个孔 7 分钟，3 次。盖上 96 孔板并储存在 4°C 直至成像。

2. 自动成像和多波长评分分析

Materials