利用微创切除系统在小鼠中进行脑肿瘤切除

摘要

来源：Alomari, S.，等．在啮齿类动物中实施微创脑肿瘤切除以实现高活性组织采集．J. Vis. Exp. （2022）

本视频演示了使用微创切除系统（MIRS）从荷瘤且已麻醉的小鼠体内切除肿瘤组织的操作过程。该手术包括将小鼠固定于立体定位仪框架上，重新打开先前的手术切口以暴露脑部，插入一种特制的套管，该套管通过负压吸引和旋转刀片来切除肿瘤组织。切除完成后，通过无菌导管收集被移除的组织，随后缝合伤口以使小鼠恢复。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 初始颅内肿瘤植入

1. 在研究的初始阶段，按照此前已发表的文献报道，向每只小鼠颅内注射100,000个悬浮于4 µL磷酸盐缓冲液（1x PBS）中的GL261小鼠胶质瘤细胞系细胞，注射深度为2.5 mm。
2. 使用以下方法量化每只小鼠的肿瘤信号 体内 肿瘤植入后9天进行成像系统检测。
   注意： 必要时，根据肿瘤负荷将小鼠分为两组。在本研究中，两组分别为：（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号 = 5.5e+006 ± 0.1e+006 光子/秒，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号 = 1.69e+007 ± 0.2e+007 光子/秒，n = 10），（p < 0.05，Mann-Whitney 检验。
3. 将每组分为两个可比的亚组。
   注意： 在本研究中，两个亚组分别为：未治疗小鼠（n = 5）和接受MIRS手术切除肿瘤的小鼠（n = 5），p > 0.05，Mann-Whitney 检验。
4. 从切除手术当天开始，使用以下方法监测肿瘤进展 体内 根据肿瘤生长模式设定成像系统的频率。
   注意： 对于GL261细胞系，在肿瘤切除当天追踪肿瘤进展，之后每3至6天追踪一次。

2. 使用 MIRS 进行肿瘤切除

1. 使用异氟烷-氧气混合气体麻醉小鼠₂ 在诱导室中使用混合气体，或腹腔注射赛拉嗪/氯胺酮溶液。
   1. 若使用气体麻醉剂，将气体流速设置为1.0 mL/min，蒸发器设置为2.0%以进行麻醉诱导，通常在麻醉舱内需要3-5分钟（参见 材料清单).
   2. 若使用注射用麻醉剂，通过注射0.2 mL麻醉剂溶液（每千克体重80-100 mg氯胺酮和每千克体重10-12.5 mg赛拉嗪，参见 材料列表）腹腔内注射。
2. 通过捏压脚趾评估动物镇静是否充分。在眼部涂抹眼药膏以防止角膜干燥。在操作前给予镇痛剂（皮下注射0.03–0.06 mg/kg布托啡诺）。
3. 将小鼠置于立体定位仪上（参见 材料表在确认完全麻醉后。
   注意： 若使用气体麻醉剂，将小鼠的鼻部置于鼻罩中，使其持续吸入异氟烷-氧混合气体₂ 操作过程中混合物（1.5%）
4. 移除先前的缝合钉，然后使用脱毛膏或剃须的方式去除毛发。使用氯己定/聚维酮碘溶液与酒精交替擦拭的方式对皮肤进行消毒。接着，用无菌手术刀沿先前的手术瘢痕做一条1 cm的纵行正中切口。
5. 通过载物台适配器/手柄支架将MIRS手柄连接到立体定位臂上，以增强稳定性和精确性。
6. 设置MIRS仪器（参见 材料表）使用以下设置（图1).
   1. 将电源线组插入后侧面板上的电源线插座。通过拨动开关（1 = 开，0 = 关）打开或关闭系统电源。
   2. 将氮气管的一端（随控制台提供）插入控制台背面面板上的公头接头中。顺时针旋转连接螺母以拧紧连接。
      注意： 软管的另一端需要连接到氮气供应源。
   3. 在将软管连接至氮气供应源之前，需确认供应压力不超过100 psig，此为控制台推荐的输入供气压力。
      注意： 控制台在接通氮气后，一旦通过脚踏板激活，便会自行产生负压。
   4. 固定真空端口的盖子并密封，以避免真空系统发生任何泄漏。抽吸系统中的任何泄漏都会影响MIRS控制台的性能。
   5. 如果在设置或引灌过程中负压低于17，请检查控制台前面的负压调节旋钮是否已调至最大值（100），确保负压系统无泄漏，并确认氮气输入压力正确。
   6. 将灰色脚踏板插头插入控制台上的灰色插座中，直至发出咔嗒声并牢固就位。
      注意： 脚踏板连接器以特定方向连接至控制台，且具有防错键设计。
   7. 将手柄的蓝色连接器插入控制台对应的蓝色接口，直至听到咔嗒声并牢固就位。
      注意： 手柄连接器以特定方向与控制台连接，且具有键控结构。
   8. 使用系统前，应先对每个手柄进行预冲洗：从小碗中吸取无菌液体，经由开口、管路和手柄，最终进入集液瓶，以确保管路和手柄内部得到润滑，从而减少组织堵塞的发生。
   9. 通过控制面板上的前方面板选择仅抽吸或抽吸结合切割的适当模式。使用脚踏板启动。
7. 将23 G MIRS套管插入骨孔，深度达2.5 mm。
8. 通过按压与套管连接的脚踏板启动切除过程。使用手柄上的控制旋钮完成一个或多个完整的切除循环（360°）。
   注意： 循环次数越多，切除的肿瘤组织体积越大。
9. 切除过程完成后，将23 G MIRS套管从骨孔中撤出，并用5 mL的1×PBS冲洗管路，以清除任何残留碎屑。
10. 将小鼠从立体定位仪中取出，使用缝合钉或4-0缝合线缝合伤口（参见 材料表).
11. 将小鼠放于加热垫上或保温灯下，待其从麻醉状态恢复后再放回笼中。
12. 实验结束后，冲洗导管 通过 灌流。交替使用冷培养基和空气，以将所有切除的组织“推”回收集罐中。从系统上取下收集罐，并用提供的盖子密封。
13. 完成步骤 2.12 后，将套管的远端尖端插入 3% H₂O₂ 在24–25 in Hg负压下抽吸，使抽吸管路回流至抽吸收集瓶，静置60–90秒。使用无菌培养基间歇性地以脉冲方式冲洗空气和培养基。
14. 观察小鼠术后是否出现任何神经学症状（异常的不规则运动或癫痫发作）。

结果

图1：MIRS系统设置。（A）用于啮齿类动物模型脑肿瘤的微创切除系统（MIRS），配备集成的组织保存系统。（B）MIRS控制台前面板。1 = 系统电源，2 = 脚踏开关，3 = 灌注按钮，4 = 吸引，5 = 吸引力度调节旋钮，6 = 吸引力度指示器，7 =...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿那静（赛拉嗪注射液，100 mg/mL）	Covetrus	33198
麻醉系统	Patterson Scientific	78935903
麻醉废气收集容器	Patterson Scientific	78909457
C57Bl/6，6-8 周龄小鼠	Charles River Laboratories	品系编号 027
异氟烷	Covetrus	11695-6777-2
异氟烷挥发器	Patterson Scientific	78916954
氯胺酮	Covetrus	11695-0703-1
Kopf 立体定位仪	Kopf Instruments	5001
Lightfield 显微镜	BioTek	Cytation 5
微量注射装置	Kopf	5001
微型电机钻	Foredom	F210418
MRI 系统	Bruker	7T Biospec Avance III MRI 扫描仪
NICO Myriad 系统	NICO Corporation
眼科软膏	Puralube vet ointment
木瓜蛋白酶	Sigma Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
青链霉素双抗	Millipore Sigma	N1638
Percoll 溶液	Sigma Aldrich	#P4937
移液器控制器	Falcon	A07260
聚维酮碘溶液	Aplicare	52380-1905-08
RPMI 培养基	Invitrogen	INV-72400120
手术刀片	Covetrus	7319
手术刀柄	Fine Science Tools	91003-12
皮肤标记笔	Time Out	D538,851
缝钉拆除器	MikRon	ACR9MM
缝钉器	MikRon	ACA9MM
缝钉	Clay Adams	427631
立体定位仪	Kopf Instruments	5000
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378
缝线，Vicryl 4-0	Ethicon	J494H