基于病毒载体的基因疗法在小鼠模型中恢复听力的研究

摘要

来源：Akil, O., et al., 通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了将治疗性基因递送至因基因突变导致听力丧失的幼鼠内耳的操作过程。通过腺相关病毒（AAV）载体，将基因经由圆窗膜注射入内耳，使病毒颗粒进入毛细胞，恢复谷氨酸转运蛋白的表达，从而重建向大脑传递声音信号的功能。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术前动物准备

1. 在洁净、专用的空间内进行手术操作。所有手术器械均需经过高压灭菌，并在手术前使用玻璃珠灭菌器进行灭菌。
   注意：本方案中使用出生后第10至12天（P10-12）的FVB小鼠。可根据具体研究需求选用不同年龄和品系的小鼠。P40日龄以上的小鼠操作难度较大，因其鼓泡骨会逐渐变硬。
2. 通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）、盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）和乙酰丙嗪（2 mg/kg）的混合物对小鼠进行麻醉。只有当动物对疼痛刺激（如脚趾夹捏）不再产生反应时，方可开始手术准备。必要时可追加麻醉混合液（剂量为初始剂量的五分之一），以维持原有的麻醉深度。
   注意：此步骤需格外谨慎，因该年龄段小鼠的大多数死亡案例均由麻醉过量引起。
3. 在麻醉期间，使用保护性眼膏覆盖动物眼睛，以保持眼球湿润，防止角膜干燥，因麻醉会抑制动物的眨眼反射。
4. 为防止麻醉后低体温，在整个手术过程中直至小鼠完全清醒前，均应将其颈部伸展置于加热垫上。
5. 手术操作前，使用剃毛器剃除左侧耳后区域的毛发，并用70%乙醇和聚维酮碘进行消毒。

2. 手术操作与载体注射

1. 采用耳后入路暴露鼓泡。用小剪刀切开皮下组织，暴露耳后肌。将切口后侧的脂肪组织向后牵拉，分离切口左右两侧的肌肉，垂直于切口方向以暴露颞骨。确保切口足够长，以便操作时视野充分、操作舒适。
2. 用25 G针头穿刺鼓泡，并用镊子向后剥离骨质，必要时扩大穿刺孔，以进入耳蜗基回，随后进一步扩大开口，以便观察镫骨动脉和圆窗膜（RWM）。
3. 用硼硅酸盐玻璃毛细移液管在圆窗膜中心部位轻柔穿刺。此时可见液体自圆窗膜流出，此为正常现象。等待流出液稳定（用无菌滤纸吸干耳蜗流出的液体）。
   注意：操作玻璃针时需小心持握并缓慢推进，尽量使圆窗膜穿孔最小化。根据所使用的显微镜类型，可使用显微操作器或手持移液管夹持器来固定移液管。
4. 使用拉针仪制备注射用移液管，制备方法与膜片钳移液管相同。确保移液管尖端直径较大（约15 µm），以便于病毒的吸入和推出。
5. 将1至2 µl的腺相关病毒（AAV1-VGLUT3、AAV1-GFP或AAV2-GFP）吸入注射移液管中。待液体流出稳定后（5至10分钟），通过先前在圆窗膜上制造的同一穿孔，将固定体积的病毒微量注射至鼓阶内。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Butler Schein
赛拉嗪	AnaSed
乙酰丙嗪	由UCSF LARC提供
聚维酮碘	Betadine Puredue Pharma
地塞米松眼膏（TobraDex）	Alcon
加热垫	Braintree scientific, inc.
25G针头	BD	305127
硼硅酸盐毛细移液管	World precision instruments, inc.	1B100F-4
解剖显微镜	Leica		MZ95
Flaming/Brown微移液管	Sutter Instrument Co
拉制仪型号P-97
TDT BioSig III系统	Tucker-Davis Technologies