将人源性中间神经元前体细胞移植到小鼠幼崽海马体中

摘要

资料来源：Gonzalez-Ramos， A.， et al.， 将人类干细胞衍生的 GABA 能神经元移植到出生后早期小鼠海马体中以减轻神经发育障碍。J. Vis. Exp.（2022年）

该视频演示了将人源性中间神经元前体细胞立体定向注射到抑制性中间神经元减少的转基因小鼠幼崽的海马体中，旨在恢复兴奋性抑制平衡。

方案

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1.海马内细胞移植

注意：本节中的所有步骤均在动物设施的细胞培养罩外进行。考虑到出生当天的 P0，在 P2 上进行出生后早期细胞移植到大脑中。

按照

1. 以下步骤准备移植实验。
   高
   1. 压灭菌所有手术材料，或者，如果不可能，用另一种经批准的方法进行灭菌。
   将
   2. 注射注射器安装在支架中，没有任何玻璃毛细管。用水冲洗针头。
      注意：针头必须为 33 G。
   将
   3. 30 G 胰岛素针头的尖端弯曲 90°。
   4. 创建一个自制的培乐多式舞台，用于将幼犬头部平放（图 1A）。
   5. 在为手术准备任何东西之前，先拿起母亲和幼崽的鼠笼，让它们适应新环境。
   6. 准备一个装有湿冰的托盘和一个装有异氟醚的纸的空笼子。
麻醉
2. 小鼠幼崽。
   用
   1. 异氟醚浸泡一张纸（参见 材料表）并将其放入空笼子内。小心地把一只幼崽放在笼子里，用纸浸泡在异氟醚中。
      注意：切勿将少于三只幼崽留在妈妈身边。异氟醚麻醉时间不要超过 20-30 秒，否则幼犬可能会死亡。
   通过
   2. 停止运动验证麻醉效果。
   3. 麻醉后，立即将幼犬放在湿冰表面的湿纸巾上。将动物放在冰上3分钟，直到上肢变白（图1B，蓝色箭头）。这通常需要 2-3 分钟。
   4. 利用这段时间将细胞悬液装入注射器。之前用移液器小心地重悬细胞。
   5. 将幼犬放在立体定位框架上。以相反的方向使用耳杆（图 1A，洋红色箭头）。
      注意：耳杆的背面不那么尖，由于 P2 幼崽没有耳朵，因此请使用较平坦的一侧以避免伤害动物。
   6. 从侧面检查头部是否笔直。头部必须平坦;使用类似培乐多的舞台来调整。
      注意：这个年龄段的幼犬还没有睁开眼睛，因此不需要在这方面采取额外的措施。幼崽在这个年龄段没有皮毛，因此不需要剃除该区域。没有给予特定的疼痛治疗，因为它不是皮肤的开放性切口，也不涉及缝合。
   7. 在整个手术过程中，将幼犬盖在冰上（在薄纸上）。
      注意：请勿将冰块直接接触幼犬的皮肤。
3. 进行注射。
   使用浸泡在
   1. 乙醇中的软组织清洁皮肤表面。
   2. 识别 lambda 并将坐标设置为零，在立体定位仪的数字显示控制台上（图 1C，黄色虚线）。矢状缝线和羔状缝合线很容易被眼睛看到，因为它们被血管化为红线。
      注意：如果难以想象 lambda，请在皮肤上放一小块冰块，等待几分钟让它冷却下来。然后，取出冰块，皮肤的微妙美白会让你想象出来。
   将
   3. 注射针重新定位到所需的坐标。在所描述的方案中，目标区域是海马体，坐标如下：前后 （AP） +0.85 和中外侧 （ML） +1.35。
   4. 使用弯曲 90° 的胰岛素针头穿透颅骨并形成一个小孔。
   放
   5. 下注射针，直到它穿过头骨，并将背腹侧 （DV） 坐标归零。降低针头，直到达到所需的 DV 坐标。在所描述的协议中，坐标为DV −1.1。
   6. 根据预定的时间间隔注射。
      注意：在所描述的方案中，确切的时间如下：（i）下降到DV坐标后，等待3分钟，（ii）注射1μL体积5分钟，以及（iii）注射所有体积后，等待3分钟。
   7. 慢慢缩回针头。
4. 结束该过程。
   注意：手术不能持续超过 15 分钟，以确保幼犬的生存并避免低温麻醉造成的任何损害。
   1. 用手加热幼崽，直到它开始移动，然后再把它送回给妈妈。
   在
   2. 移植前至少2天和移植后（PT）3周，在0.5%蔗糖溶液中给予浓度为1mg / mL的DOX作为饮用水，以继续体内细胞分化。

结果

图1：P2新生小鼠幼崽的S形定位移植。） 类似培乐多的舞台用于将幼犬的身体固定到位，并倒置耳杆（洋红色箭头）。（B） 白色前爪（蓝色箭头）表明该区域的血流量减少，因此幼犬正在通过体温过低进行麻醉。（C）幼崽已经在软纸巾上被冰覆盖的设置概述。（c#）小狗头部的闭合变焦，注射针已经插入大脑（黄色虚线表示 lambda ...

材料