将人源性中间神经元前体细胞移植至幼鼠海马区

摘要

来源：Gonzalez-Ramos, A., 等. 将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了将人源性中间神经元前体细胞立体定位注射到抑制性中间神经元减少的转基因幼鼠海马区，旨在恢复兴奋-抑制平衡。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 海马内细胞移植

注意：本节所有步骤均在动物实验设施内的细胞培养罩外进行。考虑到出生当天为P0，细胞向脑内的早期移植在P2阶段进行。

1. 按照以下步骤准备移植实验。
   1. 对所有手术器械进行高压灭菌，若无法实现，则采用其他经批准的方法进行灭菌。
   2. 将注射器安装在固定架上，不连接玻璃毛细管。用水冲洗针头。
      注意：针头必须为33 G。
   3. 将30 G胰岛素针头的尖端弯曲成90°。
   4. 制作一个类似培乐多彩泥的平台，用于固定幼鼠，使其头部保持水平（图1A）。
   5. 在准备任何手术用品前，先取出带有母鼠和幼鼠的鼠笼，使其适应新环境。
   6. 准备一个装有湿冰的托盘和一个内有滤纸的空鼠笼，用于异氟烷麻醉。
2. 麻醉幼鼠。
   1. 将一张滤纸浸入异氟烷（见材料表），放入空鼠笼中。小心取出一只幼鼠，放入含有浸有异氟烷滤纸的鼠笼内。
      注意：切勿使与母鼠同笼的幼鼠少于三只。异氟烷麻醉时间不得超过20–30秒，否则幼鼠可能死亡。
   2. 通过观察运动是否停止来确认麻醉效果。
   3. 麻醉后立即把幼鼠放在湿冰表面的湿润纸巾上。将动物保持在冰上3分钟，直至其上肢呈现苍白状（图1B，蓝色箭头）。此过程通常需要2–3分钟。
   4. 利用这段时间用细胞悬液填充注射器。注射前需用移液器轻轻重悬细胞。
   5. 将幼鼠置于立体定位仪上。将耳杆反向安装（图1A，品红色箭头）。
      注意：耳杆背面较钝，由于P2阶段的幼鼠尚无耳朵，应使用较平坦的一面以避免伤害动物。
   6. 从侧面检查头部是否平直。头部必须保持水平，可使用类似培乐多彩泥的平台进行调整。
      注意：此年龄段的幼鼠尚未睁眼，因此无需采取额外措施。此阶段幼鼠无毛发，无需剃毛。由于未对皮肤进行开放性切口，无需缝合，因此不给予特殊镇痛处理。
   7. 在整个手术过程中，将幼鼠覆盖在冰上（置于纸巾上方）。
      注意：切勿让冰直接接触幼鼠皮肤。
3. 进行注射。
   1. 使用浸有乙醇的软纸巾清洁皮肤表面。
   2. 确定人字缝位置，并将立体定位仪数字显示控制台的坐标设为零（图1C，黄色虚线）。矢状缝和人字缝因含有血管呈红色线条，肉眼清晰可见。
      注意：若难以辨识人字缝，可在皮肤上放置一小块冰，等待数分钟使其冷却。随后移除冰块，皮肤轻微变白有助于观察。
   3. 将注射针移动至目标坐标。在本实验方案中，靶向区域为海马体，坐标如下：前后（AP）+0.85，内外（ML）+1.35。
   4. 使用90°弯曲的胰岛素针头穿透颅骨，制造微小孔洞。
   5. 下降注射针直至穿过颅骨，将背腹（DV）坐标归零，再继续下降至目标DV坐标。在本实验方案中，DV坐标为−1.1。
   6. 按照预设的时间间隔进行注射。
      注意：在本实验方案中，具体时间为：（i）下降至DV坐标后等待3分钟，（ii）在5分钟内注射1 µL体积，（iii）注射完成后继续等待3分钟。
   7. 缓慢回撤针头。
4. 结束操作。
   注意：手术总时长不得超过15分钟，以确保幼鼠存活，并避免因低温导致的麻醉相关损伤。
   1. 用手温暖幼鼠直至其开始活动，再将其归还母鼠。
   2. 在移植前至少2天至移植后（PT）3周内，提供含1 mg/mL DOX的0.5%蔗糖溶液作为饮用水，以持续诱导细胞在体内的分化。

结果

图1： S出生后第2天对新生小鼠进行立体定位移植。 (A使用类似橡皮泥的支架来固定幼鼠的身体位置，并采用倒置的耳杆（品红箭头）。B白色前爪（蓝色箭头）表明该区域血流减少，因此幼鼠正因低温而处于麻醉状态。C<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G 针头	B Braun	4656300
Hamilton 注射器用 33 G 针头	Hamilton	7762-06
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J	Jackson Laboratory	17482	动物模型
C57BL/6J	Janvier Labs		动物模型
数字立体定位仪	KOPF	Model 940
多西环素	Sigma-Aldrich	D9891	2 µg/mL
乙醇	Solveco		70%、95%、99.8%
H1 (WA01) 胚胎干细胞	WiCell	WA01	在 MTA 协议下的 人类胚胎干细胞系
Hamilton 注射器	Hamilton	7634-01	5 µL
异氟烷 Baxter	Apoteket AB
小鼠立体定位适配器	RWD	68030
嘌呤霉素（盐酸二氢盐）	Gibco	A1113803
镊子	VWR