琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

摘要

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了将携带目的基因的质粒载体注射到胚胎脑切片中的中间神经元前体细胞内，随后进行电穿孔以实现质粒进入并表达基因的操作步骤。这些经过修饰的前体细胞后续可用于脑部疾病的治疗。

方案

1. 局部DNA注射
   1. 准备表达载体的脱氧核糖核酸（DNA）混合物：pCAGGs-IRES-GFP（对照载体）+ pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP，每种载体浓度为1 µg/µL。加入快绿溶液（储存液25 mg/mL），按1/10比例稀释。
   2. 用拉制的玻璃微量移液管（内径0.5 mm，外径1 mm）吸取10 µL DNA混合液，向脑片选定区域（内侧神经节隆起或MGE/尾侧神经节隆起或CGE）注射少量液体（25–50 nL范围内）（图1和图2）。
2. 急性电穿孔
   注意：电穿孔应在局部DNA注射后立即进行。
   1. 将小块琼脂糖放置在培养皿电极上，使用平头微型刮刀将琼脂糖柱固定在可移动盖电极上。
   2. 将带有支撑膜的脑片转移至琼脂糖块上，并将顶部电极连同琼脂糖柱置于脑片的选定区域（MGE/CGE）上方。
      注意：施加125 V电压（两次脉冲，每次5 ms，间隔500 ms）可实现有效的电穿孔（图3）。
3. 电穿孔后，将带有支撑膜的脑片放入培养皿中，并转移至37 °C的CO₂组织培养孵育箱中。

结果

图1：用于急性电穿孔实验的代表性端脑切片。（A-C）在三个不同的连续头尾水平获取端脑切片，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。LGE：外侧神经节隆起；MGE：内侧神经节隆起；CGE：尾侧神经节隆起。比例尺 = 200 µm。黄色星号表示每张切片中的电穿孔位点。白线标记神经节隆起的边缘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基/补充物
Neurobasal 培养基	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21103-049	神经元基础培养基
设备
电穿孔仪	BTX	ECM 830 generator
急性脑片电穿孔用注射器	Eppendorf	FemtoJet Microinjector
Kite 手动显微操作器	WPI	KITE-M3-R
铂电极 (I)	Protech International Inc.	CUY-700-1
铂电极 (II)	Protech International Inc.	CUY-700-2
不锈钢底板	WPI	5479
其他材料
电穿孔用玻璃毛细管	VWR	1B100-4
组织培养皿	BD Biosciences (Falcon)	353037