在脊髓延髓肌萎缩症小鼠模型中注射重组腺相关病毒载体

摘要

来源：
Pourshafie, N., 等. 利用重组腺相关病毒9型系统性递送microRNA治疗啮齿类动物神经肌肉疾病. J. Vis. Exp. (2018).

在本视频中，一只患有脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）的小鼠通过尾静脉注射接受携带编码治疗性微小RNA质粒的重组AAV（腺相关病毒）载体。该载体产生的微小RNA可结合突变的AR（雄激素受体）mRNA（信使核糖核酸），从而触发其降解。这有助于减少毒性蛋白的积累，并改善神经肌肉功能。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. AAV-miRNA 质粒尾静脉注射

注意：此步骤需根据目标基因以及小鼠的年龄和体重进行调整。请依据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导原则，结合小鼠的年龄和体重确定给药剂量范围、给药体积及最佳给药途径。在注射后约2周起，预期可在目标组织中观察到绿色荧光蛋白（GFP）荧光信号及miRNA表达水平达到峰值。以下实验方案适用于成年早期的雄性小鼠。AAV应按照生物安全等级1（Biosafety Level 1）指南作为生物危害物进行操作。

1. 使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将AAV-miRNA质粒储备液分装为100–200 µL的等份，每毫升含10¹⁰–10¹¹个病毒基因组（vg/mL）。操作AAV溶液时应穿戴实验室生物危害个人防护装备。
   注意：等份样品解冻后可在4 °C保存最多两周。病毒储备液可存放于-80 °C冰箱中。
2. 将小鼠固定在市售的固定装置中，例如适当尺寸的塑料管或锥形塑料薄膜管。
3. 用70%酒精擦拭尾部表面。
4. 在尾部下方放置温热垫（28–30 °C）30秒，以促进血管扩张。也可选择使用红色加热灯（距离2–3英尺）或将其尾部浸入温水中对动物进行加温。
5. 从尾部远端开始，将装有病毒等份液的针头（27–30 G）斜面向上，与尾部呈15°角插入静脉。注射前需确认针头已正确插入。
   1. 若注射过程中感到阻力或皮下出现肿胀，应立即停止操作。拔出针头，并在前一次注射部位上方重新穿刺。
      注意：也可通过轻轻回抽针管观察是否有血液进入来确认位置。强力回抽可能导致尾静脉塌陷。若注射时静脉变白，则表明针头已正确插入。
6. 完成注射后，等待数秒再拔出针头。
7. 观察注射部位是否出血。用两指对注射部位施加适度压力，直至出血停止。
8. 将动物放回笼中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
规格	佩卢兹	SP5
纳尔吉恩桶	赛默飞世尔科技	12014000	4000 mL
微量离心管	美国科学公司	1615-5500
乳酸林格氏液	百特医疗	0338-0114-04
小型涡旋混合器	费舍尔科技	128101
离心机	艾本德	22624415
实验室封口膜	贝米斯	PM996
1 mL 注射器	BD	309626	附带 25g 针头。注射时需更换为 27–30g 针头
30g 针头	BD	305106
异氟烷	皮拉莫尔医疗	66794-013-25	异氟烷 USP 250 mL
麻醉面罩	Kopf 仪器公司	906
纱布	亨利·谢恩	100-2524	2" x 2" (5 cm x 5 cm)
移液器吸头	美国科学公司	1111-0816
微量移液器	吉尔森	4642080
气体麻醉蒸发器	SurgiVet	4214322	Classic T3
气体麻醉废气清除装置	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
加热垫	西尔斯	17280
实验台垫	VWR	56617-006
转棒仪	Panlab/哈佛仪器	76-0772	4 只大鼠 / 4 只小鼠
70% 乙醇	Decon 实验室公司	2401	140 proof
70% 异丙醇	VWR	89108-160