小鼠模型中脑内注射肠道来源的微生物代谢物

摘要

来源：Liou, C. et al. 在自由活动小鼠中进行脑室内给予肠道来源微生物代谢物。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频演示了在自由活动的小鼠中进行颅内注射短链脂肪酸（SCFAs），以研究其对脑介导行为的影响。将注射套管插入预先植入小鼠脑内的导向套管中。小鼠恢复后，在新环境中适应。随后给予短链脂肪酸，并记录其运动行为。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 实验动物的准备

1. 从供应商处获取6-8周龄的野生型C57BL/6JNarl雄性小鼠。
2. 将小鼠饲养在标准鼠笼中，自由摄取标准鼠粮和灭菌水。​
   注意：实验动物中心的饲养条件为温度22 ± 1 °C，湿度55% ± 10%，光照/黑暗周期为13小时/11小时。

2. 立体定位手术

1. 准备并灭菌立体定位仪、手术器械及相关物品。
   注意：所有将直接接触手术部位的物品均应灭菌，以避免感染。
2. 将小鼠置于含1%-5%氧气异氟烷的有机玻璃容器中进行麻醉。
   注意：密切观察小鼠，确保其呼吸频率维持在每秒约一次。
3. 将小鼠从麻醉舱中取出，使用宠物修剪器剃除手术部位（小鼠头部）的毛发。将小鼠的门齿固定在立体定位仪的门齿杆上，并将其置于立体定位架上，用鼻罩覆盖其鼻部。
4. 在整个立体定位手术过程中，使用含1%-2.5%异氟烷的氧气对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏反射评估小鼠的痛觉反应，并在切开手术部位前确保其呼吸频率稳定。
5. 在立体定位架下的小鼠身下放置加热垫（37.0 °C），以维持其术中体温。或者，可通过连接程序控温仪与加热垫的直肠温度探头来维持核心体温。
6. 使用胶带去除头部残留的毛发。皮下注射镇痛药酮洛芬（5 mg/kg）以缓解疼痛。涂抹眼膏以防止眼睛干涩。
7. 将尖头耳棒插入耳道以固定头部。
8. 通过调节耳棒的刻度使头部居中。
9. 拧紧门齿夹上的夹具以防止头部垂直移动。轻压头部以确认其已牢固固定，避免在后续手术过程中头部松动。
10. 使用棉签蘸取氯己定，对头皮进行三次交替擦拭消毒。每次擦拭均从中央向外围进行（从最洁净的中心区域向较不洁净的外围区域）。
    注意：从中心向外擦拭的方法有助于科研人员最大限度地减少毛发带来的感染和污染风险。外围区域靠近未剃毛的头部区域，仍残留较多毛发，难以彻底消毒。
11. 使用手术刀沿前后方向切开头皮（<1 cm）。撑开切口后，用显微镊夹持棉签擦拭颅骨。
    注意：显微镊、手术刀和棉签必须在术前经高压灭菌。在手术过程中，每次处理不同动物前后，均须使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对所有手术器械灭菌至少5秒。准备一个已灭菌的烧杯，用于在手术过程中及动物间歇期间存放手术刀和镊子。
12. 在颅骨上识别前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。以前囟作为参考点，定位目标区域。
    1. 可选步骤：将立体定位钻安装至立体定位钻架上，并用钻头尖端对准前囟作为参考点。使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对立体定位钻灭菌至少5秒。
13. 以前囟/后囟为基准，校准并调整颅骨在左右和前后方向上的水平平面。
    ​注意：若未达到正确的水平面，需重新将小鼠安装至立体定位仪上。

3. 商业定制导向套管植入

1. 根据立体定位坐标确定右侧脑室的位置并进行标记：前囟（Bregma）距离，前后方向（A/P）：0.26 mm，内外方向（M/L）：-1.0 mm，背腹方向（D/V）：-2.0 mm。
   注意：可根据感兴趣区域调整坐标。该脑室坐标基于体重为26–30 g的成年C57BL/6J小鼠设定。
2. 使用立体定位钻在已标记的位置钻孔（直径 = 1.5 mm），用于植入商用导向套管。
3. 使用立体定位钻在颅骨上再钻2至4个孔（直径 = 1.5 mm），用于安装不锈钢螺钉。
   注意：每次操作动物前后，均需使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对立体定位钻灭菌至少5秒。
4. 用棉签清除骨屑并止血。
5. 用棉签将利多卡因（1 mg/kg）涂抹于颅骨表面，发挥局部麻醉、止痒和镇痛作用。若钻孔后出血不止，可将棉签轻压于孔口以实现止血。
6. 在钻孔处安装2至4枚不锈钢螺钉，作为牙科丙烯酸树脂的固定锚点。
7. 将商用导向套管安装至立体定位套管夹持器上，并用玻璃珠灭菌器（150 °C）进行消毒。
   注意：商用导向套管、商用假插件和商用注射器（图1A）均根据材料表中所示规格定制。
8. 将立体定位套管夹持器移至为脑室预留的钻孔位置，缓慢将商用导向套管插入孔中，直至达到目标深度（2.5 mm）。
   注意：背腹方向坐标可通过将商用导向套管尖端作为参考点来确定，当尖端刚好插入孔中时即为起始位置。
9. 在钻孔处滴加10 µL 正丁基氰基丙烯酸酯粘合剂（组织粘合胶）以固定商用导向套管，静置3–4分钟。随后从立体定位套管夹持器上轻柔释放导向套管，并移开夹持器。
10. 在切开的头皮处涂抹牙科丙烯酸树脂，以进一步固定商用导向套管，静置至少5分钟。将商用假插件插入商用导向套管中，防止血液或体液堵塞套管（图1B）。
11. 松开耳杆并从立体定位仪框架上取下小鼠。
12. 将小鼠放入配备底部加热垫的新笼中，使其从麻醉中恢复，并持续观察直至完全清醒。​
    注意：在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不应与其他动物合笼饲养。
13. 根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程及实验设计，将小鼠单独饲养或群养。若采用群养，应减少每笼小鼠数量，以最大限度降低意外伤害或套管脱落风险。
14. 术后至少3天内在饮水中添加布洛芬（0.2 mg/mL）进行术后护理，并每天至少两次监测疼痛与不适症状，持续至少3天。
    1. 术后护理期间，在小鼠皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，以预防炎症和感染。
    2. 持续监测动物状态，并及时给予腹腔注射5%葡萄糖和/或0.9%氯化钠溶液，以提供充足能量。
    3. 若疼痛、不适或感染状况持续恶化，应通过吸入CO₂实施安乐死。
15. 术后等待1周，待小鼠恢复后即可进行短链脂肪酸（SCFAs）脑室内给药及行为学测试。

短链脂肪酸（SCFAs）的制备

1. 将乙酸钠、丁酸钠和丙酸钠溶解于人工脑脊液（ACSF）中（参见材料表）。
2. 确保化学品完全溶解后，调节pH至7.4，并将短链脂肪酸混合液通过0.22 μm滤膜过滤以灭菌。

5. 在行为学测试期间建立用于向脑室内递送短链脂肪酸的输注系统

1. 安装一个天花板摄像头以记录行为。将摄像头连接到计算机以控制视频录制软件（图2）。
2. 用蒸馏水填充一支10 μL微量注射器。
   注意：避免微量注射器中产生气泡。
3. 将微注射泵与微注射控制器连接。
4. 将微量注射器安装到微注射泵上。安装时，按下按钮松开夹具，将注射器安装到相应位置，关闭夹具并拧紧微注射泵上的推杆固定螺钉（图3A）。
5. 将商用注射器插入聚乙烯管中（图1A）。
6. 将聚乙烯管悬挂在测试区域上方的天花板摄像头处。
7. 使用胰岛素注射器将蒸馏水注入聚乙烯管中。将微量注射器连接至悬挂的聚乙烯管。​
   注意：确保聚乙烯管足够长，以便小鼠能够在整个测试区域内自由移动。

6. 显微注射控制器的系统设置

1. 打开显微注射控制器，按下“显示所有通道”以进入命令界面（图3C）。按下“配置”，将“目标体积”设为 9,800 nL，“输送速率”设为 100 nL/s。从连接至微升注射器的聚乙烯管中注入 9,800 nL 去离子水（按下“方向”切换至“注入”模式，然后按下“运行”）（参见 图3C 命令界面中的红色方框）。
2. 按下“配置”，将“目标体积”设为 3,000 nL，“输送速率”设为 100 nL/s。从聚乙烯管中回吸 3,000 nL 矿物油（按下“方向”切换至“回吸”模式，然后按下“运行”）（参见 图3C 命令界面中的红色方框）。
   注意：应在聚乙烯管中观察到清晰的油-水相分离。
3. 将聚乙烯管从微升注射器针头拆下。从微升注射器针头中排出 3,000 nL 去离子水（按下“方向”切换至“注入”模式，然后按下“运行”）。
4. 将微升注射器重新插入聚乙烯管中。按下“配置”，将“目标体积”设为 9,500 nL，“输送速率”设为 100 nL/s。回吸 9,500 nL 短链脂肪酸（SCFAs）（按下“方向”切换至“回吸”模式，然后按下“运行”）。标记油-SCFAs 相，以确认 SCFAs 是否成功注入。
5. 按下“配置”，设置所需的“目标体积”和“输送速率”为 7 nL/s。按下“方向”切换至“注入”模式（参见 图3C 命令界面中的红色方框）。
   注意：根据注入时间确定体积。例如，若注入时间为 3 分钟，输送速率为 7 nL/s，则目标体积 = 1,260 nL。
6. 按下“运行”，向前推动微升注射器，直至液体从商品化注射器前端流出，然后再将注射器插入套管中进行 SCFAs 注射。

7. 通过商品化导管套管向自由活动小鼠的侧脑室灌注短链脂肪酸（SCFAs）

1. 将小鼠放入含有1%-5%异氟烷的氧气中的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）笼内，使其麻醉。
   注意：密切观察小鼠，确保其呼吸频率维持在每秒约一次。
2. 固定小鼠颈部皮肤，将商用注射器插入商用导向套管（图3B）。
   注意：若商用导向套管被血液或体液堵塞，可用镊子轻轻疏通。
3. 在进行行为学测试前，将小鼠置于笼中恢复麻醉状态15分钟。
4. 在基础运动测试中，将小鼠放入新笼中，使其自由探索35分钟。在前5分钟内以7 nL/s的输送速率注入短链脂肪酸（SCFAs），目标体积为2,100 nL（将方向按钮设为注入模式并按下运行）。
   注意：新笼中的小鼠运动行为可使用动物行为视频追踪软件进行分析。
5. 再次麻醉小鼠（重复步骤7.1），并从商用导向套管中取出商用注射器。​
   注意：在给予足够时间以清除前一次注射物质后，可对小鼠重复注射不同的对照物或代谢物。只要套管固定在小鼠头部，即可反复使用不同代谢物进行测试。

8. 显微注射系统的恢复

1. 将聚乙烯管从微量注射器上拆下。
2. 使用胰岛素注射器向管内注入空气，以排出聚乙烯管中的蒸馏水。排空微量注射器。
3. 在配置界面按下“重置位置”（Reset Pos），打开注射器止点设定界面（图 3C）。
4. 按下“回吸”（Withdraw）直至发出蜂鸣声，将显微注射泵重置至完全回缩位置（图 3C）。
5. 返回命令界面，若屏幕上显示 **END REACHED** 提示，则关闭显微注射控制器（图 3C）。

结果

图1：商业引导套管在小鼠体内的植入。 （A）商业引导套管、假芯和注射器的代表性图像。（B）通过牙科丙烯酸树脂固定，将商业引导套管和假芯植入小鼠脑内的代表性图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
瓶顶真空滤器，500 mL，0.22 μm，PES，无菌	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF：0.14 g/L
2% 氯己定擦洗液	Phoenix	NDC 57319-611-09
氯己定溶液	Phoenix	NDC 57319-599-09
商用假插件	RWD Life Science	62004	Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
商用导向套管	RWD Life Science	62104	Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm
商用注射器	RWD Life Science	62204	Single_OD 0.21 mm-33G/ 与 M3.5 配合使用/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF：0.61 g/L
牙科丙烯酸树脂	HYGENIC	n/a
固定螺钉	RWD Life Science	62521
马血清	ThermoFisher Scientific	16050130
胰岛素注射器	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
异氟烷	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF：0.19 g/L
酮洛芬	Swiss Pharmaceutical	n/a
利多卡因	AstraZeneca	n/a
低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF：0.19 g/L
显微镜载玻片	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
轻质矿物油，白色 NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF：7.46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF：0.18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF：1.76 g/L
n-丁基氰基丙烯酸酯粘合剂（组织粘合胶）	3M	1469SB	3M Vetbond
神经示踪剂	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
聚乙烯管	RWD Life Science	62329	外径 1.50，内径 0.50 mm 和外径 1.09，内径 0.38 mm
Puralube Vet（眼用）软膏	Dechra	12920060
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs：13.5 mM
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
丁酸钠	Sigma-Aldrich	B5887	SCFAs：8 mM
丙酸钠	Sigma-Aldrich	P1880	SCFAs：5.18 mM
不锈钢导向套管	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	外径 0.63 mm；本地供应商
不锈钢注射器	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	外径 0.3 mm；假插件由注射器制成；本地供应商
强力胶	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
设备
套管固定器	RWD Life Science	B485-68217
天花板摄像头	FOSCAM	R2
数字立体定位仪	Stoelting	51730D
解剖显微镜	INNOVIEW	SEM-HT/TW
玻璃珠灭菌器	RWD Life Science	RS1501
加热垫	Stoelting	53800M
显微解剖镊	ROBOZ	RS-5136	带齿，轻微弯曲；超精细；0.5 mm 尖端宽度；4 英寸长度
显微解剖剪	ROBOZ	RS-5918	4.5 英寸斜角锋利剪
微量注射控制器	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch 控制器
微量注射泵	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
微升注射器	Hamilton	80014	10 µL
带双光纤的光纤冷光源	Step	LGY-150	本地供应商
宠物修剪器	WAHL	09962-2018
软件
动物行为视频追踪软件	Noldus	EthoVision	版本：15.0.1416