本文描述了一种一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，用于检测儿童粪便样本中的诺如病毒分离株并进行基因组别鉴定，该方法采用针对诺如病毒基因组中最保守区域——开放读码框1（ORF1）与开放读码框2（ORF2）连接区的特异性引物和TaqMan探针。同时详细介绍了一种非商业化的、经济高效的RNA提取方法。
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摘要
摘要
诺如病毒（NoVs）是全球各年龄段人群散发性急性胃肠炎暴发的首要原因，也是儿童住院的重要病因，其公共卫生影响与轮状病毒相当。诺如病毒属于RNA病毒，具有高度的遗传多样性，新毒株不断出现。目前已确认五个基因组，其中GI和GII组包含多种基因型和亚型，对人类感染最为重要。然而，这两种基因型的诊断仍存在困难，导致诊断和治疗的延误。1, 2, 3
从粪便样本中提取RNA最常用的方法是Qiagen公司的QIAamp Viral RNA商业试剂盒。该方法结合了硅胶膜的结合特性、可控制RNase并为RNA与层析柱的最佳结合提供条件的缓冲液，以及微型离心柱的快速操作优势。该方法简单、快速且可靠，操作步骤较少，具体细节由制造商提供说明。
诺如病毒是仅次于轮状病毒的腹泻常见病因。在所有关于腹泻发病机制的研究以及暴发疫情或个体腹泻病例中，都应具备诺如病毒的诊断能力。然而目前由于缺乏简便的诊断方法，诺如病毒的检测仅限于少数几个中心，这导致了诊断和治疗的延误1, 2, 3。此外，由于成本较高以及在国家之间运输腐蚀性缓冲液受到严格管制，使用商业化试剂盒会带来诸多物流问题。因此，本方案描述了一种替代性的、经济的、实验室自建的方法，该方法基于Boom et al. 原始方法4，利用二氧化硅颗粒对核酸的结合特性以及硫氰酸胍的抗核酸酶特性。
为检测和区分粪便标本中诺如病毒（NoVs）的基因群（GI 和 GII），已开发出多种针对不同靶区域的 RT-PCR 方法。目前普遍认为，采用 TaqMan 化学法的 RT-PCR 是诊断诺如病毒最理想的分子技术，因其兼具高灵敏度、高特异性、良好的重复性，以及高通量和操作简便等优势。本文所述检测方法针对诺如病毒基因组中最为保守的开放阅读框 1（ORF1）与开放阅读框 2（ORF2）交界区域，该区域是诺如病毒基因组中最保守的区域，因此最适合用于诊断。为进一步开展遗传学分析，可采用常规 RT-PCR 方法，扩增衣壳主要蛋白的高变异性 N 端壳区（C 区），所用引物最初由 Kojima 等人描述 等 5 详细描述了该方法。对常规PCR获得的PCR产物进行测序，可区分属于GI和GII基因群的基因型。
方案
1. 粪便样本
- 应将粪便样本冷冻保存，以维持RNA的稳定性。制备10%粪便悬液时，取约0.1 g解冻后的粪便样本，用PBS定容至1 ml。
- 将悬液分装为200 μl每份，以避免反复冻融。分装样本应储存于-70 °C。
- 使用前将分装样本解冻，并在4,000 g离心10分钟。
2. 使用胍和二氧化硅进行提取的二氧化硅颗粒的制备
- 在室温下，将30 g二氧化硅悬浮于dH₂O中并定容2O 至 250 mL。
- 沉降24小时后，用抽吸法移除215 mL上清液。加入dH2O 至 250 mL，并通过振荡使二氧化硅沉淀重新悬浮。
- 再过24小时后，用抽吸法除去上清液，并用盐酸（HCl）将二氧化硅悬液的pH值调节至2.0。将二氧化硅悬液分装至玻璃瓶中，进行高压灭菌。
3. 使用胍和二氧化硅提取的L6缓冲液的制备
- 在室温下，通过将 60 g 硫氰酸胍（GuSCN）和 1.3 g Triton X-100 溶解于 50 mL 0.1 M 盐酸-Tris（pH 6.4）和 11 mL 0.2 M EDTA（pH 8.0）溶液中，配制 L6 缓冲液。
4. 使用胍和二氧化硅提取的L2缓冲液的制备
- 在室温下，将 180 g 硫氰酸胍（GuSCN）溶解于 150 mL 0.1 M 盐酸-Tris 缓冲液（pH 6.4）中，配制 L2 缓冲液。
5. 提取步骤
- 每次提取时应包括一份诺如病毒（NoV）阳性的粪便样本作为阳性对照，以及经DEPC处理的水作为阴性对照。
- 在微量离心管中混合以下成分：1 mL 缓冲液L6、20 μL 二氧化硅颗粒，并加入200 μL 10%粪便提取物悬液。短暂涡旋混匀后，室温放置15分钟。
- 将悬液在6000 g离心10秒，沉淀用1 mL缓冲液L2洗涤两次，随后用70%乙醇洗涤两次，再用丙酮洗涤一次。将沉淀置于56 °C干式加热块中干燥5分钟。
- 通过加入50 μL无RNase的dH2O使硅胶沉淀中的RNA水合。加入1 μL RNasin，通过倒置混匀试管，于56 °C孵育15分钟。
- 在台式离心机中全速离心3分钟，收集含有RNA的上清液40 μL。
- 使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）对提取的RNA样本进行定量，然后于-70 °C保存，最多可保存6个月。（注意： 更好地保持总RNA完整性的方法是将其转化为cDNA）。
6. 使用商业RNA QIAamp病毒RNA试剂盒的替代提取方法
完整说明详见QIAGEN试剂盒附带的手册。简要步骤如下：
- 取560 μL含有载体RNA的Buffer AVL，加入1.5 mL离心管中，再加入140 μL 10%粪便悬液。短暂涡旋振荡15秒以混匀。室温孵育10分钟。
- 向样品中加入560 μL乙醇（96–100%），短暂涡旋振荡15秒混匀，然后短暂离心。
- 将630 μL上述溶液转移至置于2 mL收集管中的离心柱中。在6,000 g下离心1分钟；随后将离心柱转移至新的洁净2 mL离心管中。
- 用500 μL Buffer AW1洗涤结合RNA的离心柱，在6,000 g下离心1分钟。将离心柱放入新的洁净2 mL收集管中。
- 用500 μL Buffer AW2洗涤离心柱，在最大转速（20,000 g或14,000 rpm）下离心3分钟。
- 将离心柱放入新的洁净1.5 mL微量离心管中，加入40 μL经DEPC处理的水，在最大转速下离心洗脱RNA。重复一次，最终获得80 μL洗脱的RNA。
- 使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）对提取的RNA样品进行定量。随后于-70 °C保存，可保存长达6个月。（注意： 更佳的总RNA保存方法是将其反转录为cDNA）。
7. 采用特异性Taqman探针一步法实时RT-PCR检测提取RNA中的诺如病毒
仪器：StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems）。
方法
- 使用 RNase AWAY 擦拭并清洁所有工作台面、移液器和离心机，以去除任何潜在的 RNase 污染。
- 根据表1配制诺如病毒 GI 和 GII 筛查反应主混合液。引物和 TaqMan 探针列于表2中。
- 将 10 μL 适当的主混合液分装至每个反应管中。
- 向相应的反应孔中加入 5 μL 未稀释的未知样本 RNA、DEPC 处理水作为阴性对照，或分别加入 GI 和 GII 阳性对照 RNA。所有样本应设重复孔。浓度分别为 300 μg/μL 和 500 μg/μL 的阳性对照和标准品由国家诺如病毒实验室疾病控制与预防中心（CDC）提供。
- 将反应板在 6,000 g 离心 10 秒。
- 在实验属性设置界面中，定义并选择运行的实验类型。确保试剂类型显示为 TaqMan 试剂，并选择 Pre-PCR 读数和扩增步骤。
- 使用表3中的热循环程序运行 15 μL 反应体系。
- 分析结果。
8. 使用常规RT-PCR和测序对诺如病毒GI和GII型进行基因分型
（本视频中未提及，因为这是一种常见且广泛使用的方法。）
仪器。采用配备 Quantitec 模板的应用生物系统公司 StepOne 和 StepOnePlus 实时 PCR 系统。
方法
- 在进行基因分型之前，需通过上述筛选性RT-PCR确定样本的基因组群（GI或GII）。GI型诺如病毒（NoV）RNA必须使用GI型基因分型预混液进行扩增，GII型NoV RNA则需使用GII型基因分型预混液进行扩增。
- 根据表4配制NoV GI和GII基因分型预混液。引物GI SKF/SKR和G2 SKF/SKR列于表5中。
- 将适量的预混液各45 μL分装至0.2 mL反应管中。
- 在每个阴性对照管中加入5 μL经DEPC处理的水，向相应的反应管中加入5 μL预先筛查确认为诺如病毒（GI和/或GII）RNA阳性的样本。
- 使用表6中的热循环程序进行50 μL的PCR扩增反应。
- 将含有至少100 ng/μL扩增衣壳区片段的PCR产物送至Macrogen公司进行纯化和测序。（地址：9700 Great Seneca Hwy. Rockville, MD 20850；每样本每轮测序费用为10美元）。
9. 代表性结果
图1展示了使用TaqMan一步法RT-PCR检测腹泻患儿粪便样本中提取的RNA时的代表性结果。阳性样本的阈值循环（Ct）设定为GI型≤Ct 37，GII型≤Ct 39。阳性对照的Ct值分别为GI型ORF1-ORF2连接区小于27，GII型小于18。 点击此处查看高清大图。
图2展示了硅基自制方法（含胍盐）与QiAmp病毒RNA试剂盒在Ct值上的直接比较。两项检测的数据点均非常接近等值线（斜率为1，截距为0）。回归分析和相关系数结果进一步证实了这一点。所有阴性对照样本经两种方法检测结果均为0。
| 主混合液 | 终浓度 | 体积 (μL) |
| H2O PCR | 2.875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6.250 |
| RT Mix | 1x | 0.125 |
| 50 μM Cog R 引物 | 1 μM | 0.250 |
| 50 μM Cog F 引物 | 1 μM | 0.250 |
| 10 μM Ring 探针 | 1 μM | 0.125/0.250* |
| 10.00 |
* GI 检测中每种探针使用 0.250 μL，GII 检测中每种探针使用 0.125 μL。
表1. 用于筛查GI和GII型的Qiagen Quantitect预混液 (Trujillo et al., 2006)7
| 名称 | 基因型组 | 用途 | 序列 (5' 至 3') |
| Cog 1R | GI | 引物 | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | 引物 | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | 引物 | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | 引物 | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Ring 1A | GI | 探针 | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring 1B | GI | 探针 | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | 探针 | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
表2. 用于基因型I、II实时定量RT-PCR的引物和探针寡核苷酸序列（Kageyama et al., 2003）8
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA 合成 |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart Taq 聚合酶激活 |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45X 循环 |
表3. 一步法TaqMan实时RT-PCR的热循环程序（Trujillo et al., 2006）7
| 主混合液 | 终浓度 | 体积 (μL) |
| H20 PCR | 29.50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR Buffer | 1x | 10.00 |
| 10 mM dNTP Mix | 0.4 mM | 2.00 |
| 酶混合液 | 2.00 | |
| 40 U/μL RNAsin | 20 U/μL | 0.50 |
| 10 μM SKF | 0.1 μM | 0.50 |
| 10 μM SKR | 0.1 μM | 0.50 |
| 45.00 |
表4. 用于GI和GII基因分型的Qiagen One-Step RT-PCR预混液。
| 名称 | 基因型组 | 用途 | 序列 (5' 至 3') |
| G1SKF | GI | 引物 | 5'- CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | 引物 | 5'- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A -'3 |
| G2SKF | GII | 引物 | 5'- CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | 引物 | 5'- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT- 3 |
表5. 用于扩增衣壳区C区的引物（Kojima et al., 2002）5
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA 合成 |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart Taq 聚合酶激活 |
| 3 | 94 | 00:30 | |
| 52 | 01:00 | 40X 循环 | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | 退火 |
表6. Taqman一步法逆转录PCR的热循环程序。
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讨论
采用我们实验室自建的经济型核酸提取方法从粪便样本中提取核酸，其结果与使用Qiagen公司的商用QIAamp病毒RNA试剂盒获得的结果相当。结合本实验室建立的TaqMan反转录PCR方法，可检测属于GI和GII基因群的多种诺如病毒（NoV）基因型。近期关于C区片段检测方案的一项报道显示其基因分型成功率为78%6。由于近年来流行的诺如病毒毒株多样性不断增加，检测成功率将取决于C区引物与待测样本病毒序列之间的匹配程度。该检测方法适用于常规诊断，因其无需扩增后产物处理步骤，从而缩短了检测周转时间7。除诊断用途外，本方案还可用于阐明诺如病毒感染的流行病学特征，对疾病公共卫生防控具有重要意义。
进行筛查性RT-PCR时，引物/探针组的阴性对照（NC）反应不应出现跨越阈值线的荧光增长曲线。若某一或多个引物/探针组的阴性对照反应出现假阳性结果，则可能发生了样本污染，此时整个实验运行应作废，并在更严格遵循操作指南的前提下重新进行。
使用美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的GI和GII阳性标准品对筛查...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）国家杯状病毒实验室慷慨提供诺如病毒（NoV）的标准品和阳性对照，以及约翰斯·霍普金斯大学公共卫生学院实验室提供试剂。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异硫氰酸胍 | Sigma-Aldrich | G9277 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 二氧化硅 | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| 吐温 X-100 | VWR | 14530 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp 病毒RNA小型试剂盒 (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec 探针一步法RT-PCR试剂盒 (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen 一步法RT-PCR试剂盒 (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase抑制剂 2000单位 | A. Biosystems | N808-0119 | 2000单位/瓶 |
| 无RNA酶、防粘连微量离心管 | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure 琼脂糖 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
参考文献
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
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