光遗传学诱导长期抑制以抑制大鼠觅药行为

摘要

来源：Rich, M. T., 等．利用光遗传学逆转神经可塑性并抑制大鼠的可卡因寻求行为．J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用光遗传学技术在内侧膝状体至侧杏仁核（MGN-LA）突触诱导长时程抑制（LTD），从而减弱大鼠模型中由线索诱发的觅药行为。该大鼠通过手术植入光纤，并通过病毒转导使其表达光敏感离子通道，随后接受低频光脉冲的光遗传学刺激，触发神经递质释放并导致突触减弱。该过程通过神经递质受体的内吞作用降低MGN-LA突触传递，最终破坏线索与觅药行为之间的关联。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 啮齿类动物静脉插管、病毒递送和光纤植入

1. 为手术准备动物。
   1. 根据机构指南选择合适的麻醉剂对大鼠进行完全麻醉。一种可选方案是使用盐酸氯胺酮（87.5–100 mg/kg，肌内 [i.m.]）和盐酸赛拉嗪（5 mg/kg，i.m.）。通过检测脚趾夹捏反射是否消失，确认大鼠已完全麻醉。
      注意： 氯胺酮为管制药品，必须按照机构指南进行操作。
      注： 本研究采用肌内注射麻醉剂，因其诱导麻醉的速度和可靠性优于腹腔注射。手术过程中需持续监测大鼠的呼吸和反应性，并提供保温支持。
   2. 剃除大鼠背部较大区域的毛发（从肩胛骨上方至背部中段），以及右前肢下方颈部区域和头皮部位的毛发。
   3. 将大鼠置于手术区域，并在眼睛上涂抹Puralube（人工泪液）。通过上背部皮肤皮下注射（皮下 [s.c.]）给予体重剂量的卡洛芬（镇痛药），然后通过下背部皮肤皮下注射5 mL乳酸林格氏液。
   4. 用浸有聚维酮碘的无菌纱布以环形动作擦拭已剃毛的手术区域，对所有手术部位进行消毒。随后用70%乙醇重复该过程。交替重复此消毒流程共三次。
2. 根据已发表的实验方案进行静脉导管植入。
   注： 本手术过程中不使用手术巾，以避免导管植入时产生刺激。所有器械和设备在使用前必须灭菌。操作时佩戴无菌手套，若接触非无菌表面则需更换手套。
3. 导管植入后，立即将大鼠固定于立体定位仪中，进行腺相关病毒（AAV）注射。
   1. 在头皮部位皮下注射（s.c.）2%利多卡因（0.2–0.3 mL），作为局部麻醉。
      注： 静脉导管植入过程中不使用局部麻醉，以避免对手术结果造成干扰。
   2. 将一根26号不锈钢注射套管连接至装有1 µL浓缩AAV溶液的Hamilton注射器：可选用AAV5-hSyn-tdTomato或AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato。
      注： oChIEF是蓝光敏感视蛋白通道视紫红质（ChR2）的一种变体，能够响应较宽频率范围的光刺激，因此既适用于本方案中讨论的低频长时程抑制（LTD）实验，也适用于高频长时程增强（LTP）实验。oChIEF质粒由Roger Tsien博士惠赠，并由杜克大学病毒载体核心实验室完成包装与纯化。注射日与LTD诱导日之间需间隔至少3–4周，以确保病毒在丘脑内侧膝状体核（MGN）轴突末梢中充分表达。
      注意： 通常AAV被归类为生物安全等级1（BSL-1）生物体，除非在生产过程中使用辅助病毒，否则自感染风险较低。其使用需获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并始终根据机构指南穿戴适当的个人防护装备（PPE），以减少不必要的暴露风险。
   3. 使用手术刀从颅骨前部至后部做一条0.5 mm的切口，去除覆盖组织以暴露颅骨表面。
   4. 调整大鼠头部在前后轴上的位置，并将立体定位坐标以bregma点为零点进行校准。
   5. 使用配备小型钻头的Dremel工具在颅骨上钻三个小孔，并用螺丝刀将不锈钢螺丝（M2x4 965-A2）牢固固定。
      注： 螺丝对于牙科水泥的牢固粘附以及稳定、持久的头帽制作至关重要。螺丝位置应沿颅骨前后轴分散分布，并远离AAV注射位点。
   6. 根据《大鼠脑图谱》（Watson和Paxinos）提供的坐标，在内侧膝状体核（MGN）内侧区域双侧钻孔用于AAV注射；以bregma为参考（单位：mm），前后向（AP）：-5.4；内外向（ML）：±3.0；背腹向（DV）：-6.6。以4 mm/min的速度缓慢降低注射套管，直至其定位至MGN。以0.1 µL/min的速率注入浓缩AAV溶液。
   7. 注射完成后，将注射套管保留在原位5分钟，以利于病毒溶液从套管周围扩散，随后缓慢将套管从脑组织中撤出。
4. 病毒注射后，立即继续植入靶向MGN-LA末梢的光纤。
   1. 使用Dremel工具在颅骨上双侧钻孔，用于植入靶向外侧杏仁核（LA）的光纤（以bregma为参考，单位：mm，AP：-3.0；ML：±5.1）。
   2. 使用镊子夹住光纤植入体的陶瓷套管（ferrule），并将其固定在立体定位适配器上，确保其稳固就位。
   3. 以2 mm/min的速度缓慢降低光纤，直至光纤尖端位于LA背侧区域（背腹向 [DV]：-7.9 mm）。
   4. 首先使用一层薄Loctite瞬干胶将陶瓷套管固定于颅骨，随后用牙科水泥加固，并用直径1.25 mm的陶瓷套管护套和防尘盖覆盖陶瓷套管。
      注： 用于将陶瓷套管固定于颅骨的粘合剂应获得本地或机构动物护理与使用委员会的批准。本研究经多种粘合剂试用后，选用Loctite以可靠固定陶瓷套管；但也可考虑其他可用替代品。
5. 手术结束后，将大鼠单独饲养，并自由提供食物和饮水。术后护理应符合机构指南。每日用含庆大霉素（5 mg/mL）和肝素（30 USP/mL）的生理盐水冲洗导管，以维持通畅性。术后至少5天，并在行为学实验开始前24小时，将大鼠的食物摄入量限制至自由进食体重的约90%。

2. 啮齿类动物可卡因自我给药与操作性杠杆消退

注意：所有行为学实验均在标准的操作性条件反射箱中进行，箱体一侧装有两个可伸缩的杠杆，每个杠杆上方设有刺激灯，同时配备音调发生器、笼内照明灯和输注泵。

1. 在固定比率1（FR1）强化程序下，每天对大鼠进行1小时的可卡因（2 mg/mL）自我给药训练。
   1. 每天将大鼠放入操作箱中，允许其按压杠杆。按压指定的“活动杠杆”（左右杠杆间平衡分配）会触发一次可卡因输注（1.0 mg/kg/次）并伴随一个复合的灯光和声音信号，持续10秒。按压指定的“非活动杠杆”则无任何程序化效应。
   2. 自我给药实验至少持续10天，直至大鼠连续3天每天成功获得至少8次输注。若至第20天仍未达到习得标准，则该大鼠被排除出研究。
2. 在成功达到习得标准后，对大鼠进行每日1小时的操作性消退训练，持续6–10天。
   1. 将大鼠放入操作箱中，允许其自由按压杠杆。但此时无论按压活动杠杆还是非活动杠杆均不再产生任何程序化结果。
   2. 持续每日的操作性消退训练，直至大鼠在连续两天内的平均按压次数<25次。

3. 体内光遗传学诱导LTD

注意：光遗传学抑制实验在工具性消退训练最后一天后的24小时进行。

1. 将光纤跳线连接至473 nm蓝色激光二极管，通过悬挂在清洁的标准啮齿类动物饲养笼上方的旋转接头接入，移除笼盖。该装置允许啮齿类动物在光遗传学刺激期间在笼内自由活动。
2. 根据操作说明打开激光二极管，并连接至脉冲发生器。调节参数，使开启后大鼠接受900次、每次2 ms、频率为1 Hz的光脉冲刺激。
   注意：操作激光时必须始终佩戴适当的眼部防护装备。
3. 使用光传感器测量通过光纤跳线的光强度。调节激光强度，使光纤跳线输出的光强约为5–7 mW。
4. 将大鼠放入清洁的饲养笼中。取下防尘盖和光纤连接套管，暴露陶瓷插芯。将光纤跳线双侧连接至植入的光纤探头。在长时程抑制（LTD）诱导前，让大鼠在环境中自由探索3分钟。
5. 开启脉冲发生器以启动光遗传学刺激。
   注意：尽管可能性极低，若大鼠对刺激出现任何不良反应，应立即终止实验，并根据机构指南对大鼠实施安乐死。
6. LTD诱导完成后，将大鼠继续留在笼中3分钟，随后放回其原饲养笼中。
7. 对照实验中，对表达AAV5-tdTomato对照病毒的大鼠采用相同的刺激程序。假刺激实验中，将光纤跳线连接至表达AAV5-oChIEF病毒的大鼠的光纤植入物，但在15分钟的实验过程中不给予任何刺激。

4. 测试光遗传学刺激对线索诱导的可卡因觅药行为的影响

1. 在体内光遗传学刺激后24小时，将大鼠重新放入操作性条件反射箱中。对大鼠进行持续1小时的标准线索诱导复吸实验，以评估可卡因觅药行为。
   注意：在线索诱导复吸期间，按压主动杠杆会呈现10秒与可卡因相关的线索刺激，但不给予可卡因灌注。
2. 在第一次测试至少1周后进行第二次复吸测试，以确定光遗传学诱导的长时程抑制（LTD）是否导致可卡因觅药行为的长期抑制

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. 刺激隔离器	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke 病毒载体中心（通过 Roger Tsien）	#268
AAV5.hSyn.tdTomato（对照）	Duke 病毒载体中心对照
人工泪液（眼用软膏）	Covetrus	70349
聚维酮碘	Butler Schein	38250
盐酸可卡因	NIDA 药物供应中心	9041-001
双通道温度控制器	Warner Instruments	TC-344C
乙醇	匹兹堡大学化学试剂库	200C5000
插芯防尘帽	Thor Labs	CAPL	用于 1.25 mm 插芯的白色塑料防尘帽
插芯对接套筒	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25，青铜材质，内径 1.25 mm
插芯	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm 多模 LC/PC 陶瓷插芯，孔径 Ø230 μm
光纤	Thor Labs	FP200URT	200 μm 纤芯多模光纤（0.5 NA）
光纤旋转连接器	Prizmatix	（从亚马逊订购）	直径 18 mm，FC-FC 接头用于光纤
光纤剥线工具	Thor Labs	T12S21
庆大霉素	Henry Schein	6913
哈密尔顿注射器	Hamilton	80085	10 μL 容量，26 规格，2 英寸，3 型针尖
热风枪	Allied Electronics	972-6966	250 V，750–800 °F
热固化环氧树脂	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
肝素	Henry Schein	55737
盐酸	Fisher Scientific	219405490
盐酸氯胺酮	Henry Schein	55853	氯胺酮为管制药品，应按照机构指南进行操作
乳酸林格氏液	Henry Schein	9846
激光器、驱动器及激光-光纤耦合器	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW，473 nm，二极管泵浦固态激光器（一种选择）
利多卡因	Butler Schein	14583
光传感器	Thor Labs	PM100D	带数字显示屏的紧凑型能量计主机
乐泰瞬干胶	Grainger	5.00E+207
微电极放大器/数据采集系统	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
微量注射泵	Harvard Apparatus	70-4501	双注射器
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Orthojet 牙科水泥，液体	Lang Dental	1504BLK	黑色
Orthojet 牙科水泥，粉末	Lang Dental	1530BLK	现代配方粉末，黑色
跳线电缆	Thor Labs	FP200ERT	多模，FT030 套管
Rimadyl（卡洛芬）	Henry Schein	24751
自我给药舱/软件	Med Associates	MED-NP5L-D1
不锈钢机用螺钉	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm 机用螺钉，盘头，十字槽，A2 不锈钢，未处理，长度 3 mm
用于插芯的立体定位适配器	Thor Labs	XCL
立体定位仪	Stoelting	51603
缝合线	Fine Science Tools	18020-50	丝线；规格：5/0，直径：0.12 mm
Vetbond 组织粘合剂	Covetrus	1505