脊髓损伤后利用新型方法对小鼠后肢骨丢失进行纵向评估 体内方法学

摘要

采用连续低剂量X射线扫描，对成年小鼠脊髓损伤后股骨和胫骨的骨量流失进行了纵向检测。在整个研究期间均可检测到胫骨骨量流失，而股骨的骨量流失直至损伤后40天才被检测到。

摘要

脊髓损伤（SCI）常伴随骨盆及下肢损伤以下区域的骨质疏松，导致骨折发生频率升高¹。由于这些骨折常发生在已丧失正常感觉功能的区域，患者面临更高的骨折相关病理风险，包括死亡。SCI 引起的骨矿物质密度（BMD，g/cm²）和骨矿物质含量（BMC，g）下降被认为与力学失用²、异常神经信号传导³以及激素变化⁴有关。采用啮齿类动物 SCI 诱导骨质疏松模型，可为揭示 SCI 后骨质疏松发生机制提供宝贵信息，并为开发新疗法提供测试平台^5-7（综述见⁸）。小鼠 SCI 模型备受关注，因其可通过使用基因敲除小鼠和转基因小鼠，实现基于机制的简化论评估。尽管这些模型已提供了重要数据，但仍亟需建立微创、可靠、可重复且可量化的检测方法，以评估 SCI 后骨量丢失的程度，尤其是在同一实验动物群体中进行纵向观察，从而改进对 SCI 诱导骨质疏松的诊断、治疗方法及预防策略。

一种理想的啮齿类动物骨密度测量方法应允许多次、连续（随时间推移）暴露于低剂量X射线辐射。本研究描述了一种新型全身扫描仪IVIS Lumina XR（Caliper Instruments）的应用，该仪器可用于在脊髓损伤（SCI）后随时间推移获取小鼠后肢骨骼的低能量（1–3毫戈瑞（mGy））、高分辨率、高倍率X射线图像。与未受伤、年龄匹配的对照（ naïve）小鼠相比，脊髓横断术后10天即可观察到小鼠胫骨显著的骨密度下降（减少13%，p<0.0005）。SCI后第10天亦可检测到股骨远端骨密度下降，而股骨近端的密度下降则直至伤后40天才可检测到（减少7%，p<0.05）。通过双能X射线吸收测定法（DXA）——当前骨密度测量的“金标准”——在死后验证了SCI依赖性的小鼠股骨密度下降。我们使用IVIS Lumina XR在SCI后40天检测到小鼠股骨骨矿物质含量（BMC）下降了12%。这一结果与Picard及其同事先前报道的结果相当，他们在SCI后30天通过死后DXA分析检测到小鼠股骨BMC下降13.5%⁹。我们的结果表明，IVIS Lumina XR提供了一种新颖的、高分辨率/高倍率的方法，可用于在SCI后对小鼠后肢骨密度进行长期、纵向的测量。

方案

1. 小鼠脊髓横断模型

1. 使用氯胺酮（200 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）联合麻醉成年雄性C57BL6小鼠（体重约20-25 g）。所有手术操作均在机构批准的IACUC手术室内无菌条件下进行。
2. 待小鼠深度麻醉后，使用电动剪刀修剪背部毛发。剃毛区域先用碘溶液擦拭，再用70%乙醇消毒。
3. 在初次切口前，先在拟切开的背部区域浸润局部麻醉药（Marcaine，浓度0.25%，<1ml/kg），以减轻术后疼痛。
4. 使用小型剪刀在L2区域附近皮肤上做一个小切口，并用同一把剪刀纵向延伸切口至T2区域。然后使用止血钳将皮肤切口边缘撑开固定。
5. 随后使用显微剪清除胸段第8节（T8）背侧脊柱板上的肌肉组织。T8的定位方法如Kuh和Wrathall（1998）所述¹⁰。简而言之，可通过其背侧棘突识别T13，再使用#5 Dumont镊子触诊并识别最后一根肋骨，由此向后计数至T8。清理完毕后，使用骨咬钳在T8处进行背侧椎板切除术。
6. 完全性脊髓横断损伤：暴露T8节段脊髓后，在手术显微镜下使用另一套灭菌的显微剪沿垂直于脊髓长轴的平面将其完全切断。我们使用#5 Dumont镊子轻轻提起脊髓一端，以确认损伤的完整性。
7. 脊髓横断后，将一小块浸有无菌生理盐水（0.9%）的无菌明胶海绵小心置入损伤腔内，以促进止血。
8. 再取另一块明胶海绵覆盖于暴露的脊髓表面，随后使用无菌不锈钢手术钉合闭皮肤。将动物放回其原有笼具，置于纸巾上以防吸入垫料，并使用加热垫保温约12小时。在早期恢复期间，向笼内提供水凝胶包（ClearH2O）和置于笼底的食物颗粒。动物从麻醉中恢复后，可在笼内自主获取食物和饮水。
9. 所有损伤动物在整个研究期间（40天）均接受每日两次的手动膀胱排空处理（间隔约12小时），采用改良的Crede手法。
10. 损伤小鼠在术后前三天每日两次腹腔注射0.9%生理盐水（0.5 cc）以维持水合状态，并在术后五天内每日两次注射阿片类药物布托啡诺（0.05 mg/kg）以控制术后疼痛。若动物在初始5天后仍表现出疼痛迹象，则每日追加一次布托啡诺（0.05 mg/kg），直至疼痛症状（活动减少、蜷缩姿态、不梳理毛发、触碰时发声）消失为止。

2. 使用IVIS Lumina XR对同一组脊髓横断小鼠进行骨密度的纵向评估

1. 从脊髓损伤（SCI）后第10天开始，每隔10天进行一次评估，直至第40天，对活体麻醉状态下的受试动物（完全横断SCI组和未受伤的同龄对照组）的右侧和左侧股骨及胫骨进行检测。
2. 扫描当天，将受试动物连同其饲养笼从机构的动物饲养区转移至安置Caliper IVIS Lumina XR设备的房间。所有受试动物均使用先前在SCI造模过程中所用的相同氯胺酮/赛拉嗪混合麻醉剂进行麻醉。该麻醉混合物可维持1至1.5小时的麻醉状态，足以完成整个扫描过程。
3. 研究人员启动Lumina XR设备，并等待其内部相机达到工作温度（-90°C）（约10分钟）。
4. 动物麻醉后，将其（SCI组或对照组）轻柔地放置于Lumina XR设备内的动物平台上。将高倍放大镜头插入设备中，以便聚焦于股骨和胫骨区域（使用高倍镜头时视野为2.4×2.4 cm）。若动物位置不当导致肢体超出视野范围，需打开舱门重新调整位置，直至左或右后肢居中（见图2a，显示后肢正确放置方式）。
5. 当动物位置正确后，可执行X射线功能。在能量下拉菜单中选择适用于Animal（活体动物，35 kV，100 µA，滤波X射线）的设置。
6. 动物位置调整妥当后，在控制面板中勾选X-Ray以启用X射线功能，然后点击Acquire获取X射线图像。确保整个股骨和胫骨均清晰可见（见图2b）。原始图像数据将自动保存至硬盘，同时保存具有代表性的.TIFF文件。随后将小鼠放回其饲养笼中，在研究人员观察下恢复。之后对下一只小鼠重复上述流程。
   注意：Living Image软件默认显示经过转换的X射线图像。若需查看原始X射线图像，请取消勾选“校正/滤波工具”中的X-Ray Absorption选项。当X射线数据已校正吸收效应后，可通过比较感兴趣区域（ROI）的信号强度来评估相对骨密度。ROI的强度随组织密度的增加而增强。

3. IVIS X射线扫描的图像分析

1. 双击 Living Image 图标以打开软件。
2. 单击以加载 X 射线图像 浏览 按钮。在出现的对话框中，选择目标文件夹，然后单击 好的. “活体成像”浏览器会显示所选数据，以及用户ID、标签信息和相机配置信息。要打开数据，请执行以下操作之一：双击数据行，或右键单击数据名称并选择 加载 在快捷菜单中，选择数据行并单击 加载，或双击缩略图。图像和工具面板将显示。在浏览器中，已打开的数据以绿色高亮显示。
3. 点击 ROI 工具 工具面板中。在 ROI 工具，选择 测量感兴趣区域 从“类型”下拉列表中选择。要加载本实验中使用的3个ROI，请单击 方形 图标并加载3个方块。
4. 使用直尺测量股骨的长度。将其中两个方格的长度调整为股骨长度的1/8^th 占股骨总长度的比例。将这两个方块的宽度调整为股骨总长度的1/24。使用直尺测量1/8^th 从股骨近端起算，位于股骨总长度1/4处，并将方框置于股骨中心位置。第二个方框应位于距股骨远端1/4股骨总长度处（图3）。这些感兴趣区域（ROI）可用于测量股骨近端和远端区域。
5. 使用直尺测量胫骨的长度。将第三个方格的长度调整为1/8^th 胫骨总长度的1/30，调整宽度至^th 占胫骨总长度的。将方块置于正中央，且距离为1/8^th 胫骨总长度，即从胫骨近端开始的距离（见图3）。
6. 点击 测量 图标（一支铅笔和一把尺子）。ROI 强度测量结果将显示在 X 射线图像中，同时 ROI 测量表格也会出现。 导出 将此表格另存为 .csv 文件并移至所需位置，以便使用 Excel 打开。
7. 对所有已保存的图像重复此操作。
8. 将所有数据汇总到一个 Excel 工作表中。使用 Microsoft Excel 或 SigmaPlot 11.0 软件（Systat Software）通过学生 t 检验确定统计学显著性。

4. 骨密度的死后分析：

1. 在 IVIS Lumina XR 中完成最后一次纵向 X 射线扫描后，使用 Beuthanasia（75 mg 戊巴比妥/kg）对小鼠进行深度麻醉。达到深度麻醉状态后，用含肝素（40 mg/升）的冰冻磷酸盐缓冲液对小鼠进行经心脏灌注，以清除血液。
2. 清除血液后，切除两侧股骨。需特别注意尽可能去除所有软组织，因为已有研究表明软组织会影响密度测量结果¹¹。将股骨用浸湿的纱布包裹，于 -20°C 保存，直至准备进行分析。

5. 使用Hologic QDR 4000骨密度仪进行DXA分析

1. 解冻浸有纱布的股骨，并转移至骨密度测量室。
2. 根据制造商的方案校准仪器；确保骨矿物质含量（BMC）和骨密度（BMD）值处于可接受范围内。
3. 在机器中放置一个黄铜准直器。该装置可使用户限制X射线束的尺寸和角度，从而聚焦于特定目标区域。
4. 将解冻后的股骨浸入盛有水的培养皿中（髁部朝左，股骨与床面平行），并将其置于激光右侧附近。
5. 在扫描前，输入该股骨的生物信息（包含动物标识信息、处理方式等的描述性标题）。
6. 从选择菜单中点击扫描，然后选择regionA hi-res。设定扫描参数：扫描区域为 2 × 0.7489 英寸，线间距为 0.01 英寸，点分辨率为 0.00499 英寸。
   注意：扫描过程中需持续监控。当X射线束对样品进行光栅扫描时，应确保腔室内有足够的水完全覆盖骨样本。
7. 在分析选择菜单下点击分析。根据提示将整个股骨标记为感兴趣区域（ROI）。系统将生成报告页面，显示计算出的BMC（克）和BMD（g/cm²）。
8. 重复上述步骤，分析其余股骨样本。
9. 将所有数据汇总至一个Excel表格中，并进行统计分析（t检验）。

6. 代表性结果：

通过上述方法，可以检测到脊髓损伤后小鼠胫骨和股骨相对于正常小鼠的相对骨密度下降。损伤后仅10天即可观察到骨密度显著降低（下降12%，p<0.0005），至40天时骨密度下降可达15%（p<0.0005，图4）。股骨的骨密度下降在损伤后40天被观察到（下降7%，p<0.05，图5）。这些结果证明了非侵入性X射线成像可用于脊髓损伤后骨密度变化的纵向观察。

为了将该方法的疗效与现有方法进行比较，我们在小鼠损伤后40天通过DXA成像分析了其切除的股骨。数据输出的代表性结果见图6。我们发现，与未处理小鼠相比，脊髓损伤（SCI）小鼠的骨矿物质含量显著降低（减少12%，p<0.05，图7）。骨矿物质密度虽未发生显著变化，但也呈现出类似的趋势（图8）。这些结果与文献报道相似；Picard等人观察到骨矿物质含量（BMC）下降13.5%（p<0.001），但骨矿物质密度（BMD）无显著下降（Picard 2008）。

图1. 实验时间线。

图 2. 左侧后肢的代表性方位：a）照片和 b）X射线图像。

图3. 股骨近端和胫骨区域中感兴趣区域（ROI）的尺寸与方向。

图4. 脊髓损伤后近端胫骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度变化（n=5），与年龄匹配的幼稚组（n=5）相比。误差线表示标准误（SEM）；**p<0.005，*** p<0.0005。

图5. 脊髓损伤（SCI）后近端股骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度变化（n=5），与年龄匹配的未损伤对照组（n=5）相比。误差线表示标准误（SEM）；*p<0.05。

图6. 脊髓损伤后远端股骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度变化（n=5），与年龄匹配的幼稚对照组（n=5）相比。误差线表示标准误（SEM）；*p<0.01-0.05；**p<0.001-0.01；***p<0.0001-0.001；****p<0.0001。

图7. DXA数据的代表性图像，显示骨矿物质含量（BMC）和骨密度（BMD）结果。

图8. 脊髓损伤（SCI）小鼠受伤后40天股骨骨矿物质含量（克）的DXA分析（n=5），与年龄匹配的对照组（naïve，n=5）比较。误差线表示标准误（SEM）；*p<0.05。

图 9. 脊髓损伤（SCI）小鼠受伤后40天股骨骨矿物密度（mg/cm²）的DXA分析（n=5），与年龄匹配的未处理小鼠（n=5）比较。误差线表示标准误（SEM）；无显著差异。

讨论

本研究介绍了一种新颖的、非侵入性方法，利用Caliper IVIS Lumina XR成像系统，在同一组小鼠中纵向评估个体骨骼（胫骨和股骨）内的密度变化。在为期40天的检测期内，与年龄匹配的未受伤对照小鼠相比，脊髓损伤（SCI）导致脊髓横断小鼠模型中双侧股骨和胫骨的骨密度下降。通过死后使用DXA对股骨结果进行验证，表明Caliper Instruments IVIS Lumina XR系统的应用可作为一项敏感的测量工具，用于评估脊髓损伤对骨量流失的长期及进行性影响。

使用该系统的研究人员可能获得的一个优势是，能够纵向追踪脊髓损伤（SCI）后动物后肢骨骼病理变化的发展过程。能够在长时间内对同一队列进行评估，为研究人员带来以下优势：1）成本方面：与需要大量动物并在特定时间点处死以评估时间依赖性变化的研究相比，这些病理结果可以在同一队列中随时间推移进行连续观察，从而降低动物购买和长期饲养相关的成本；2）变异性方面：除了与对照组队列进行比较外，还可以在研究过程中对同一组损伤动物在不同时间点的结局进行评估和比较，从而进一步减少个体内部变异，并降低对更大实验动物群体的需求。

尽管Caliper IVIS Lumina XR系统为我们提供了有关SCI诱导骨质疏松症发展过程的重要纵向信息，但仍存在一些需要考虑的局限性：1）虽然该平台使我们能够获取小鼠脊髓损伤后后肢骨骼的高分辨率X射线数据，但其应用可能仅限于小鼠等小型啮齿类动物。Lumina XR系统允许的最大被检体高度为2.8 cm，超过此高度的样本无法使用Lumina XR的X射线组件成功成像。在我们的实验中，这限制了我们对体重在200–250克范围内的大鼠进行研究。尽管可能对低于该体重范围的大鼠或其他啮齿类动物（如仓鼠或沙鼠）进行成像，但这需要由主要研究人员进一步测试验证。2）关节定位。研究者必须仔细地将动物肢体摆放成一种易于重复的标准化方位，以确保不同成像会话之间的有效比较。肢体位置的标准化将使研究者能够生成并应用标准化的感兴趣区域（ROI），这些ROI可保存并在不同个体及不同时间点之间统一使用。

总体而言，我们认为IVIS Lumina XR为建立小鼠脊髓损伤（SCI）相关骨质疏松的模型提供了一个极佳的平台。能够在同一批小鼠中纵向研究骨量丢失，使我们得以：1）更深入地理解SCI后骨量丢失和脱矿质过程的时间动态特征；2）确定这些变化是否会随时间趋于稳定；3）利用现有的转基因和基因敲除小鼠品系，以还原论的方式探索介导这些病理变化的分子机制；以及4）可能最为重要的是，开始测试旨在预防损伤早期骨质疏松发生，或在骨质疏松已形成后逆转此类变化的新型干预手段。最后，Lumina XR除了具备优异的X射线成像能力外，还可用于在活体动物中检测生物发光和荧光信号。我们可以很容易地设想，结合该系统提供的其他成像模式，从机制层面研究SCI或其他任何导致骨质疏松的疾病过程中决定骨动态的多种因素。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production