在小鼠中诱导腓神经损伤以研究神经肌肉接头再生

摘要

来源：Dalkin, W.，等．腓总神经损伤方法：一种可靠检测修复神经肌肉接头因素的实验方法．J. Vis. Exp. （2016）

本视频演示了一种在小鼠中诱导腓神经损伤的手术操作，用于研究神经肌肉接头（NMJ）的再生。该操作包括暴露腓神经，施加可控压力以诱导损伤，并确保神经外膜保持完整，以支持轴突再生。随着时间推移，巨噬细胞清除轴突碎片，促进神经修复及神经肌肉接头的重新建立。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术前动物准备

1. 使用无菌1 ml胰岛素注射器，通过皮下腹股沟注射给予小鼠氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。溶剂为含有0.9%生理盐水、17.4 mg/ml氯胺酮和2.6 mg/ml赛拉嗪的混合溶液。注射后将动物放回笼中，等待药物起效。
   注意：若初始剂量在操作过程中未能提供足够的麻醉效果，可追加注射初始剂量的25%。
2. 注射后监测动物，观察其呼吸频率是否稳定以及意识水平是否适当降低。通过夹捏后肢足部检查意识水平，充分麻醉时应无反应。
   注意：通常情况下，一只平均体重为25至30 g的成年小鼠需要3-5分钟起效。若动物在注射后10分钟仍存在反应，可追加注射麻醉初始剂量的25%。
3. 将石蜡油和轻质矿物油眼用软膏涂抹于动物眼部，以防角膜干燥。将动物从笼中取出，置于清洁、平坦的表面上。使用电动理发器将所需处理的后肢从足部至骨盆区域进行剃毛，仅暴露肢体外侧部分。
4. 在剃毛区域涂抹化学脱毛剂，作用1分钟。使用实验室擦拭纸手动去除毛发。用浸有乙醇的实验室擦拭纸清洁脱毛区域。

2. 手术步骤

1. 通过高压灭菌器或其他适当方法对手术器械进行灭菌。用80%乙醇清洁手术部位和手术台。₂O. 用聚维酮碘消毒手术部位。将小鼠置于手术板上，并用肢体固定装置固定。使目标后肢保持解剖学自然位置，膝关节轻度伸展，无内旋或外旋。
2. 将动物和手术板置于手术显微镜下。通过触诊浅表解剖标志确定正确的切口位置，具体包括骨性膝关节以及胫前肌与腓肠肌之间的肌嵴。
3. 使用手术刀或弹簧剪，在普通 forceps 固定下，于皮肤上做一个约 3 cm 的切口。切口方向应垂直于腓总神经的走行方向。
4. 继续切开浅筋膜，暴露股二头肌和股外侧肌。通过切开连接两者的深筋膜，分离这两块肌肉。切开1-2厘米即可。
5. 使用机械牵开器向尾侧牵开股二头肌，暴露腓总神经。
6. 沿神经向近端追踪，直至找到其与腓肠肌外侧头肌腱的交汇处。
   注意： 暴露可能需要进一步操作回缩的皮肤和肌肉。该交点可作为神经损伤的稳定解剖标志。
7. 用精细镊子夹住神经，镊尖与腓肠肌腱外侧缘平行。对腓总神经施加稳定而有力的压力，持续5秒，进行挤压。
8. 通过手术显微镜进行目视检查，确认神经已完全压榨。损伤部位将呈现半透明状。若使用在外周轴突中表达荧光蛋白的小鼠，则损伤部位的荧光将消失。
9. 移除牵开器，并将肌肉复位至解剖位置。使用6-0丝线缝合切口，1-3针单纯间断缝合即可。将恢复中的小鼠置于清洁笼盒内的加热垫上。
10. 术后监测所有动物2小时，观察其呼吸情况及对麻醉剂的任何不良反应。在动物术后恢复后，立即通过皮下腹股沟注射给予0.05–0.10 mg/kg的丁丙诺啡作为初始剂量。随后在接下来的48小时内，每12小时追加给药一次，共给药3次。待小鼠完全恢复后，将其送回动物饲养设施。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	VetOne	501072
赛拉嗪	Lloyd Inc.	3437
丁丙诺啡	Zoopharm	1Z-73000-150910
脱毛膏（Nair）	Nair
Kim-wipes 擦拭纸	Kimtech	34155
电动剃须刀	Braintree Scientific	CLP-64800
80% 乙醇/水（EtOH/H₂O）
10% 聚维酮碘（Proviodine）
1 ml 胰岛素注射器
弹簧剪刀	Vannas	91500-09
15 号手术刀片	Braintree Scientific	SSS 15
#5 镊子	Dumont	11252-00
带反向切割针的 6-0 丝线缝合线	Suture Express	752B
啮齿类动物加热垫	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 标记的α-银环蛇毒素（alpha-BTX）	Molecular Probes	B35451
抗荧光淬灭封片剂（Vectashield）	Vector Labs	H-1000
奥林巴斯体视变倍显微镜（Olympus Stereo Zoom Microscope）	Olympus	562037192
蔡司 700 共聚焦显微镜（Zeiss 700 Confocal Microscope）	Zeiss
可调流速蠕动灌注泵	Fisher Scientific	13-876-3