本文描述了从脑组织样本制备，到使用刀刃扫描显微镜进行连续切片成像，再到数据可视化与分析的完整流程。该技术目前用于获取小鼠脑部数据，但也适用于其他器官和其他物种。
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摘要
摘要
高通量、高分辨率的三维显微成像技术的显著进展，使得在亚微米分辨率下获取大量神经解剖学数据成为可能。最早能够产生全脑尺度数据的仪器之一是刀锋扫描显微镜（Knife-Edge Scanning Microscope, KESM）7, 5, 9，该设备由作者所在实验室研发并运行。KESM 已被用于对整只小鼠大脑进行亚微米分辨率的切片与成像，揭示了神经元网络（高尔基染色）1, 4, 8、血管网络（印度墨水灌注）1, 4以及细胞体分布（尼氏染色）3的精细结构。KESM 的应用不仅限于小鼠或大脑组织。我们已成功成像了章鱼脑6、小鼠肺和大鼠脑，并正在开展对整只斑马鱼胚胎的成像工作。此类数据可极大推动连接组学10研究、微循环与血流动力学研究，并通过提供精确的真实参考数据，助力体视学研究。
本文将介绍完整的工作流程，包括样本制备（固定、染色和包埋）、KESM 配置与设置、使用 KESM 进行切片与成像、图像处理、数据准备以及数据可视化与分析。重点将放在样本制备以及所获得 KESM 数据的可视化与分析上。我们期望本文提供的详细实验方案有助于扩大 KESM 技术的可及性，并提升其应用范围。
方案
1. 标本制备：Golgi-Cox法
- 本方案严格遵循 Mayerich 等人7的方案。
- 使用异氟烷吸入麻醉使 C57BL/6J 小鼠深度麻醉，随后将其断头处死。
- 取出脑组织并置于 Golgi-Cox 固定液中（含1%铬酸钾、1%重铬酸钾和1%氯化汞的去离子水溶液）。
- 将脑组织置于 Golgi-Cox 溶液中，在室温避光条件下固定 10 至 16 周。
- 在避光条件下，用去离子水冲洗脑组织过夜。
- 将冲洗后的脑组织置于含5%氢氧化铵的去离子水溶液中，在室温避光条件下浸泡 7 至 10 天。此较长的处理时间旨在确保溶液充分渗透整个脑组织，从而使黑色沉淀物有充分机会在组织内完全形成。
- 将脑组织在室温下再次用去离子水冲洗 4 小时，然后通过梯度乙醇进行脱水：50% 和 70% 乙醇在冰箱（4 °C）中进行，85%、95%（更换3次）和100%（更换4至5次）在室温下进行。每次更换溶液后，脑组织均需在相应溶液中放置 24 小时。
- 脱水后的脑组织随后置于丙酮中（更换3至4次，每次一天），接着依次置于 Araldite-丙酮混合液中，Araldite 与丙酮的比例分别为 1:2、1:1、2:1，最后置于100% Araldite 中（更换3次，每次过夜），所有步骤均在冰箱（4 °C）中进行。
- 最后，将处理后的脑组织包埋于100% Araldite 中，并在 60 °C 下加热 3 天（参见 Abbott 和 Sotelo2 的包埋方案）。
若使用 LR White 包埋，则将样品从最后一次100%乙醇溶液中转移至 LR White 溶液中，共更换三次，每次在冰箱中过夜，这是聚合前的标准操作步骤。进行三次更换以确保充分渗透。随后将样品转移至新鲜的 LR White 溶液中，在密闭容器内于 60 °C 下聚合 24 小时，此为实现充分聚合所需的必要时间和温度。 - 图1显示了经 Golgi-Cox 染色并包埋于 Araldite 中的脑组织。
- 将固化后的样品块用环氧树脂固定在金属样品环上，并根据需要修整样品块的侧面（见图2）。
2. 标本制备：尼氏染色
- 本方案严格遵循 Mayerich 等人7所述的实验方案。
- 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行深度麻醉，随后经心脏灌注 50 mL 室温磷酸盐缓冲液（pH 7.4），接着灌注 250 mL 冷的 4% 磷酸盐缓冲戊二醛溶液（pH 7.4）。
- 然后用 100 mL 含 0.1% 硫堇染料的去离子水溶液对小鼠进行灌注，并将尸体置于冰箱（4 °C）中保存 24 小时。
- 24 小时后，将脑组织从颅骨中取出，放入新鲜的 0.1% 硫堇溶液中，在 4 °C 下保存 7 天。此步骤耗时较长，以确保硫堇充分渗透至整块脑组织中。
- 随后通过梯度乙醇溶液对脑组织进行脱色和脱水处理，起始为 50% 乙醇与水的混合液，逐步过渡至 100% 乙醇，整个过程持续 6 周。50% 至 70% 的乙醇更换液保存于冰箱（4 °C），而浓度高于 70% 的乙醇更换液则在室温下保存。
- 经过三次丙酮处理（每次在室温下持续 2–4 天）后，按照上述 1.8–1.9 步骤将脑组织包埋于 Araldite 塑料中。若使用 LR White 作为包埋介质，则遵循上述 1.10 步骤的操作方案。
3. 样本制备：印度墨水法
- 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（每20克体重注射1.7 mg氯胺酮/0.26 mg赛拉嗪）使小鼠深度麻醉，随后经心脏灌注50 mL室温磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4），接着灌注250 mL室温10%中性缓冲甲醛溶液（pH 7.4），最后灌注3.0 cc未稀释的印度墨水。
- 使用生理盐水和固定液进行全身灌注，目的是清除心血管系统中的血液并固定组织。灌注印度墨水可确保心血管系统的血管完全充填。
- 随后将脑组织依次通过梯度浓度的乙醇（25%–100%）脱水，并按照上述1.8–1.9步骤中的方案将其包埋于Araldite塑料中。若使用LR White作为包埋介质，则遵循上述1.10步骤中的方案。
4. 标本制备：通用物种，通用器官
- 对于一般情况，固定可使用10%中性缓冲福尔马林或4%多聚甲醛。
- 对于小体积组织，建议采用浸透法而非灌注法进行固定和染色。对于小型生物体或器官，染色也可在脱水过程中进行。
- 包埋步骤与上述相同，但对于远小于完整小鼠脑组织的器官或生物体，可缩短溶液浸透的时间。
5. KESM 设置与成像
- 关闭泵，打开载物台，打开相机，打开照明器。
- 升起刀片和物镜。
- 安装样品环。
- 测量样品尺寸，并为 KESM Stage Controller2 应用程序创建配置文件。
- 启动 KESM Stage Controller2 并初始化载物台。
- 降低刀片/物镜，开启泵。
- 通过旋转光路中的调焦旋钮，并调整相机相对于刀刃的视野，对物镜和相机进行调焦。
- 按下 [Go] 键以开始成像。
- 参见图 3-8。技术细节参见9, 7。
6. 图像处理与数据准备
- 将 KESM 图像栈处理器可执行文件复制到配置文件文件夹（00000、00001 等）下的数据文件夹中。
- 运行 KESM 图像栈处理器，以去除光照伪影并校正所有图像的背景强度。对所有数据子文件夹重复此步骤。
- 从数据集中生成多尺度切片，并上传至 KESM 脑图谱网络服务器，完成文件设置。
- 参见图 9。
7. 数据可视化与分析
- 使用 KESM 脑图谱进行可视化。前往 http://kesm.cs.tamu.edu 并选择相应的图谱。
- 像使用 Google 地图一样进行导航。
- 像使用 Google 地图一样进行缩放。
- 若要切换到不同深度，请从下拉菜单中选择每步进入的深度，然后点击 [+] 或 [-] 以增加或减少 z 深度。
- 使用下拉菜单调整叠加层数量。
- 使用下拉菜单调整叠加层间隔。
- 参见图 11。
- 使用 MeVisLab 进行可视化。
- 启动 MeVisLab。
- 创建一个新项目。
- 在后续操作中，可通过在命令框中输入模块名称来创建新模块。
- 创建 [Compose3Dfrom2DFiles] 模块，并进入目标文件夹。输入文件字符串后点击 [GetFileList]。确保所选图像能够完全载入内存。点击 [Create3D] 以生成三维数据。
- 创建 [SetWorldMatrix] 模块，并在“基本变换”（Elementary Transforms）下的 x、y、z 方向将“Scale”设置为合适的体素尺寸（对于 10X 0.45NA 物镜，设置为 0.6、0.7、1.0）。将 [Compose3Dfrom2DFiles] 连接到 [SetWorldMatrix]。
- 在“矩阵组合”（Matrix Composition）中，将矩阵和变换设置为“忽略”（Ignore）、“忽略”（Ignore）、“前向”（Forward）。
- 创建 [Arithmetic1] 模块，并将“Function”设置为“Invert(Max-Img)”。
将 [SetWorldMatrix] 连接到 [Arithmetic1]。 - 创建 [View3D] 模块，并将其连接至 [Arithmetic1]。
- 在 View3D 中，按住鼠标右键并移动鼠标以调整阈值。您可以裁剪区域、更改方向（按住鼠标左键移动）、切换照明模式（体绘制或最大强度投影 MIP）、开启或关闭背景等。
- 参见图 10。
8. 代表性结果：
本文提供了全脑数据及相关细节。图12-15展示了全脑印度墨水、高尔基和尼氏染色数据集1, 4, 3。
图 1. 固定、染色并包埋的小鼠脑组织
图2. 固定在样品环上的包埋小鼠脑组织标本。
图3. 刀刃扫描显微镜（KESM）。图中展示了KESM的照片，并标注了其主要组件：（1）高速线扫描相机，（2）显微镜物镜，（3）金刚石刀片组件和光束准直器，（4）样品槽（用于水浸成像），（5）三轴精密空气轴承载物台，（6）白光显微镜照明器，（7）水泵（位于后方），用于移除切下的组织，（8）用于载物台控制和图像采集的PC服务器，（9）花岗岩基座，以及（10）花岗岩桥架。
图 4. KESM 的成像原理。图中展示了 KESM 的工作原理：物镜与刀片保持固定，而固定在定位载物台上的样品以 20 nm 的分辨率和 1–5 mm/s 的行进速度移动（实线箭头所示），并在移动过程中被刮过金刚石刀片（10X 物镜使用 5 mm 宽的刀片），从而产生连续的薄切片并流过刀面（实线箭头所示）。线扫描成像在刀片尖端附近完成。
图 5. KESM 相机与物镜聚焦控制装置。
图6. KESM刀片组件及控制装置。
图7. 通过观察端口进行初始对焦。
图 8. KESM Stage Controller 2 应用程序（截图）。
图9. KESM 图像堆栈处理应用程序（截图）。
图 10. MeVisLab 应用程序（截图）。
图11. KESM脑图谱：网络界面（截图）。
图 12. KESM 全脑印度墨水数据。展示了 KESM 数据堆栈的血管数据集的体可视化结果。（a）血管数据的局部放大图，宽度约 100 µm。（b-d）小鼠全脑血管系统的三个标准视图（由高分辨率数据下采样获得），宽度约 10 mm。
图13. KESM全脑小鼠高尔基染色数据。
图14. KESM 高尔基数据细节。
图15. KESM全脑尼氏染色数据。（a）尼氏染色数据的局部放大图，约300 µm3。（b-d）全小鼠脑尼氏染色数据的三个标准视图（由高分辨率数据降采样获得）。显示横截面以清晰展示内部结构。
讨论
KESM 能够对大体积生物样本（约 1 cm3）进行亚微米级的全面扫描。此类体积足以容纳完整的小型动物器官，例如脑、肺、心脏、肾脏等。对这些器官进行扫描所获得的图像，可提供前所未有的关于器官结构组织的定量信息，并能够实现对器官多种功能特性进行计算建模，包括神经环路与网络动态、电学特性、流体与气流动力学以及肌肉动力学。
本文详细阐述的样本制备流程和分析后处理流程，有望帮助外部研究团队更便捷地使用KESM及其所产生的数据。KESM操作流程将帮助这些外部研究人员充分理解这一独特成像模式的优势与局限性。
披露
Todd Huffman 供职于 3Scan，这是一家生产和销售 KESM 技术（美国专利 #6,744,572）的商业公司。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS，项目编号#1R01-NS54252）、美国国家科学基金会（NSF，项目编号#0905041、#0079874）、德克萨斯州先进技术计划（Texas Advanced Technology Program，项目编号#ATP-000512-0146-2001、#ATP-000512-0261-2001）及德克萨斯农工大学系统（Texas A&M研究基金会，德克萨斯A&M大学和3Scan。我们感谢Bernard Mesa（Micro Star Technologies）在KESM仪器方面的技术咨询与支持。KESM的主要设计与实施工作由Bruce H. McCormick完成，他于2007年逝世。
参考文献
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- Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
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- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 4/07/2013. Citeable Link.
A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.
