执行自定义的微RNA基因芯片实验

Summary

一个简单的程序执行自定义的microRNA微阵列实验描述。这些步骤包括隔离RNA，标签的RNA和参照DNA样本，杂交到芯片，芯片扫描，量化和分析杂交信号。

Abstract

小分子RNA（miRNAs）是一个大家族〜22核苷酸（nt）长的RNA分子，在真核生物^中 1广泛表达。复杂的基因组编码至少有数百个miRNA的，这主要是抑制大量的靶基因的^{转录后2，3}的表达。 miRNA的控制范围广泛的生物过程^1。此外，miRNA表达的改变已经与人类疾病，如癌症，和miRNA可作为生物标志物疾病^{和预后4，} 5。因此，重要的是理解表达和许多不同的条件下miRNA的功能。

已采用文件miRNA表达的实时PCR技术，基因芯片和深度测序的三个主要方法。的miRNA芯片技术具有高通量的优势，一般较便宜，和大多数的实验和分析的步骤可卡尔IED在分子生物学实验室，在大多数大学，医学院校和相关的医院。在这里，我们描述了一个用于执行自定义的miRNA微阵列实验的方法。一个miRNA探针组将印上产生的miRNA微阵列玻片。 RNA是隔离的使用方法或试剂，保留小分子RNA的物种，然后用荧光染料标记。作为对照，参考相应的DNA寡核苷酸的miRNA的一个子集上，也有不同的荧光染料。参照DNA将成为展示的幻灯片和杂交质量，也将用于数据规范化。 RNA和DNA混合并杂交到芯片的幻灯片，其中包含数据库中的大多数miRNA的探针。洗涤后，幻灯片扫描获取图像，个别点强度量化。这些原始信号将得到进一步的处理和相应的miRNA表达数据分析。微安rray幻灯片可以剥离和再生，以降低芯片的成本和提高的微阵列实验的一致性。相同的原则和程序适用于其他类型的定制微阵列实验。

Protocol

1。打印自定义的miRNA芯片

1. 打印芯片的幻灯片，在一所大学或公司使用的芯片的核心设施服务。芯片制造的质量是微阵列实验的成功的最关键因素之一。如果可能的话，尝试一些服务。理想的情况下，人会一次打印50-100幻灯片，和所有的幻灯片看起来相同，具有很好的分离，个别景点，。
2. 对于芯片的支持，我们使用的差距II涂层的幻灯片。
3. 对于miRNA的探针，我们使用NCode多物种的miRNA微阵列探头设置V2的。
4. 溶于3 × SSC在10μM所有的寡核苷酸和异体四上打印的幻灯片。根据GAAPS第二张幻灯片的说明，修复紫外线照射的幻灯片。标签幻灯片用钻石笔，以纪念该地区与印探头方。储存在22 ° C。

2。样品制备

1. 任何方法或试剂可用于分离RNA的，只要它保留了小分子RNA。我们通常使用的Trizol（Invitrogen公司），提取总RNA，令人满意的数量和质量的RNA制剂_作为一个_260nm一 280nm处读数计量，。
2. 对于RNA标记，混合〜25μg总RNA 5' - PCU - DY547 - 3"在1个缓冲区（的50 mM HEPES，pH值7.8，MgCl _2的 20毫米，10微克/ ml的BSA，10％与0.5微克二甲基亚砜）〜20单位T4 RNA连接酶1〜10毫米DTT和〜0.02-0.03终....

Discussion

尽管深度测序技术的最新进展，芯片仍然是一个可行的选择，为高通量DNA和RNA分析。深度测序相比，微阵列实验比较便宜，一个典型的分子生物学实验室可以执行大部分的实验和数据分析的房子，允许灵活性和节省时间。在未来的芯片可能非常适合集中审问的基因，例如集，全部或在基因组或miRNA的转录因子的一个子集，这里提出相同的原则和程序可以用于定制微阵列实验研究此外miRNA的基因家族。当然，关于芯片的主要缺点是序列信息，必须提供一个先验。这不是一个问题，大部分的模式生物的蛋白质基因家族，虽然有多少miRNA基因仍不清楚。我们一直使用的探针组的目的是基于miRBase ⁸ 9，10，这是明显的，最丰富和最生物学相关的哺乳动物的miRNA已经通过这个探头设置。

有没有重大的技术挑战，以执行自定义的微阵列实验。根据我们的经验，微阵列实验的成功的关键是:1）获得印制的幻灯片，2）RNA质量好，并准备足够数量，以及3）正确洗杂交后的幻灯片。 Trizol试剂通常产生足够数量的后续研究完整的RNA.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
项目	供应商	目录编号	评论
NCode多物种的miRNA微阵列探头设置V2	Invitrogen公司	MIRMPS201	设计的基础上miRBase 9.0版（2006年10月）。它包含〜1140未修改，34-44 NT长寡核苷酸作为探针蠕虫，蝇，斑马鱼，小鼠，大鼠，和人类的miRNA，和内部控制探头，如snoRNAs。成熟的miRNA，因此〜44 NT的大小序列互补的miRNA探针的双峰。进行分析，可以从一个特定的基因组（S）的兴趣集中在miRNA的。
Trizol法	Invitrogen公司	15596018	我们也用丰富，标注的小RNA的一小部分，虽然总RNA样本更快，更容易准备和量化，适合于下游应用，如基因分析。
T4 RNA连接酶1	新英格兰生物学ABS	M0204L
Ulysis的Alexa Fluor 647核酸标记试剂盒	Invitrogen公司	U21660	该试剂盒或类似的产品可用于实验RNA样品或对照RNA（而不是控制DNA）以及标签。
5' - PCU - DY547 - 3"	Dharmacon	产品订制	小RNA的分数可以用同样的标记结扎。
CentriSep列	普林斯顿分离	CS - 901
GAPSII涂幻灯片	康宁	40004	也可能使用其他类型的幻灯片。
微阵列杂交商会	康宁	2551或40080	其他种杂交室和盖玻片还应工作。使用市售的杂交机可以显著减少杂交时间，例如，1〜2小时。
Lifterslips	钍ermo /伊利科学	25X60I - M5439 - 001 - LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	安捷伦