进行定制化 microRNA 芯片实验

摘要

本文介绍了一种进行定制 microRNA 微阵列实验的简单流程。步骤包括 RNA 的提取、RNA 与参考 DNA 的标记、将样品杂交至微阵列芯片、扫描微阵列、以及杂交信号的定量与分析。

摘要

microRNAs (miRNAs) 是一类庞大的分子家族 ˜ 长度为22个核苷酸（nt）且在真核生物中广泛表达的RNA分子 ¹复杂的基因组编码了至少数百种miRNA，这些miRNA主要在转录后水平抑制大量靶基因的表达 ^{2, 3}miRNA 调控多种多样的生物学过程 ¹此外，miRNA 表达的改变与人类疾病（如癌症）相关，miRNA 可能作为疾病的生物标志物及预后指标 ^{4, 5}因此，了解在多种不同条件下miRNA的表达及其功能显得尤为重要。

目前已有三种主要方法用于miRNA表达谱分析：实时PCR、微阵列和深度测序。miRNA微阵列技术具有高通量、通常成本较低的优点，且大部分实验与分析步骤可在大多数大学、医学院及其附属医院的分子生物学实验室中完成。本文描述了一种定制miRNA微阵列实验的方法。将miRNA探针集打印在玻璃载片上以制备miRNA微阵列。采用能够保留小RNA组分的方法或试剂提取RNA，然后用荧光染料进行标记。作为对照，针对部分miRNA设计的参考DNA寡核苷酸也用另一种荧光染料进行标记。该参考DNA可用于评估载片质量和杂交效果，并用于数据归一化。将标记后的RNA与DNA混合后，杂交至包含数据库中大多数miRNA探针的微阵列载片上。洗涤后，对载片进行扫描以获取图像，并对各个点的荧光强度进行定量。这些原始信号将进一步处理和分析，作为相应miRNA的表达数据。微阵列载片可经剥离后重复使用，以降低微阵列成本并提高实验的一致性。相同原理和操作流程也适用于其他类型的定制微阵列实验。

方案

1. 定制miRNA微阵列的打印

1. 使用大学或公司的基因芯片核心设施服务打印基因芯片载片。基因芯片制备的质量是基因芯片实验成功最关键的要素之一。如果可能，尝试多家服务提供商。理想情况下，应一次性打印50至100张载片，所有载片应外观一致，点样清晰、独立且互不重叠。
2. 对于基因芯片载体，我们使用GAPS II包被的载片。
3. 对于miRNA探针，我们使用NCode多物种miRNA基因芯片探针试剂盒V2。
4. 将所有寡核苷酸溶解于3 × SSC中，浓度为10 μM，并在载片上进行四次重复打印。根据GAPS II载片的说明，通过紫外照射固定探针。使用钻石笔在载片上标记探针打印区域及方向。于22°C保存。

2. 样品制备

1. 只要能够保留小RNA，任何方法或试剂均可用于RNA的提取。我们通常使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，所得RNA的产量和质量均令人满意，可通过A_260nm和A_280nm的吸光度值进行测定。
2. 进行RNA标记时，将约25 μg总RNA与0.5 μg的5'-pCU-DY547-3'⁶混合于1×缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.8，20 mM MgCl₂，10 μg/ml BSA，10% DMSO）中，并加入约20单位的T4 RNA连接酶1，同时补充约10 mM DTT以及约0.02–0.03体积的10×T4 RNA连接酶1缓冲液以提供ATP。
3. 将反应体系置于冰箱内冰上孵育2–24小时进行标记。用0.3 M醋酸钠和3倍体积的乙醇沉淀RNA。为确保连接和沉淀效率，应将总RNA溶解至浓度超过2 mg/ml，并将总体积维持在约20 μl。
   1. 若RNA量较少，可按比例减少输入RNA和5'-pCU-DY547-3'的用量。
   2. 若RNA浓度极低，可加入酵母tRNA等载体以促进沉淀。
4. 使用Ulysis Alexa Fluor 647核酸标记试剂盒⁶，对标记哺乳动物miRNA子集的一组参考DNA寡核苷酸（总量为1 μg）进行标记，作为杂交过程的对照。用CentriSep柱纯化标记后的DNA，并避光保存于-20°C。

3. 微阵列杂交

1. 首次使用芯片时，将芯片浸入过滤的预杂交液（3 x SSC、0.1% SDS、0.2% BSA）中，在37 °C下预杂交30–60分钟。随后将芯片在水中浸泡数次，再浸入异丙醇中。使用配有芯片转子的离心机，在22 °C下以100 g离心5分钟，将芯片干燥。

注意：我们使用 Corning 微阵列杂交室和 Erie Scientific 的 mSeries Lifterslips 进行微阵列杂交。

2. 将盖玻片依次用水、乙醇冲洗，然后在空气中干燥。将一张载玻片放入微阵列杂交室底座内，再将盖玻片置于载玻片上方。盖玻片将覆盖探针区域，其白色条带与载玻片接触。
3. 在避光条件下，离心沉淀标记的 RNA，用 70% 乙醇洗涤一次，然后将沉淀在空气中干燥。沉淀物应呈微红色。
4. 配制杂交溶液，其中包含 400 mM Na₂HPO₄（pH 7.0）、0.8% BSA、5% SDS、12% 甲酰胺⁶，以及每份 RNA 样品加入 1/15–1/100 μl 纯化后的标记参考 DNA（2.4）。所加入参考 DNA 的量取决于标记的寡核苷酸种类数量（2.4）。若超过 100 种，则所需稀释倍数较低。
5. 用约 60 μl 杂交溶液充分溶解 RNA 沉淀。
6. 向 Corning 微阵列杂交室底座的每个加湿孔中加入 20 μl 水。
7. 将标记的 RNA 与参考 DNA 的混合液加至载玻片上。使用细尖移液枪头，轻轻接触盖玻片边缘，使溶液通过毛细作用进入盖玻片与载玻片之间的空隙。
8. 将杂交室盖置于底座上，然后用金属夹密封杂交室。
9. 将整个杂交室放入 Corning 杂交盒配套的塑料袋中。
10. 将杂交盒放入内衬湿润纸巾的容器中，用塑料薄膜覆盖容器，并置于 37°C 恒湿细胞培养孵箱中孵育约 24 小时。这些措施（3.6、3.9、3.10）可确保杂交溶液在孵育过程中不会干燥。

4. 杂交后处理

1. 逐一拆卸腔室盒。将一张载玻片及其提升片浸入22°C的2 x SSC中。提升片会自然从载玻片上脱落。将其放入0.8 x SSC中。将载玻片在0.8 x SSC中洗涤两次，然后在0.4 x SSC中洗涤三次，总时间1-2分钟。使用配有载玻片适配器的离心机干燥载玻片。用清水洗涤提升片并保存，以备后续重复使用。
2. 使用任何合适的扫描仪（例如Perkin Elmer ScanArray 5000或Molecular Devices Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪）扫描载玻片。在波长接近547 nm和647 nm处进行扫描，以获得相应的图像文件。
3. 使用BlueFuse等程序对4.2步骤中获得的图像文件进行像素强度定量。利用该程序检查各个点样区域，排除微阵列上异常的点样区域，不再进一步分析。这些异常点通常源于载玻片打印质量不佳或杂交后操作不当。
4. 使用GeneSpring和Excel等程序进行数据分析和展示。微阵列数据的标准化需遵循通用原则，相关内容超出本文范围。
5. 在4.3步骤获得满意信号后，可剥离微阵列载玻片以重复使用⁷。先用清水冲洗载玻片，然后将其浸入预热的、含1 mM NaOH和0.1 x SSC的染色缸中，在62°C下孵育10-20分钟。重复孵育一次。在22°C下轻轻振荡，用清水洗涤载玻片数次，总时间不超过60分钟。使用离心机干燥载玻片，并在22°C下保存。
6. 对于再生后的载玻片，无需再次进行预杂交。使用前只需依次用清水和异丙醇洗涤，并在杂交前立即干燥即可。

5. 典型结果：

我们已广泛采用所述方法对数千个样本中的全局miRNA表达谱进行分析，这些样本包括在多种不同条件下从斑马鱼到人类标本中分离的RNA。图1展示了一张微阵列的扫描图像，以显示载玻片上非常精确且强烈的杂交信号。微阵列杂交技术重复样本之间的皮尔逊相关系数约为0.99⁷，表明具有极佳的可重复性。

图1 杂交后扫描的miRNA微阵列玻片的复合图像。红色斑点由参考DNA杂交产生，绿色斑点由DY547标记的RNA样本产生，而黄色斑点则是DNA和RNA同时与相同探针杂交的结果。

讨论

尽管深度测序技术近年来取得了显著进展，微阵列（microarray）仍然是进行DNA和RNA高通量分析的可行选择。与深度测序相比，微阵列实验成本较低，且典型的分子生物学实验室可在内部完成大部分实验操作和数据分析，从而提高了灵活性并节省了时间。未来，微阵列可能特别适用于对特定基因集合进行深入研究，例如基因组中全部或部分转录因子或miRNA；本文所介绍的基本原理和操作流程同样可用于针对除miRNA外其他基因家族的定制化微阵列实验。当然，微阵列的一个主要局限在于必须事先具备已知的序列信息。 先验的。对于模式生物中的大多数蛋白质编码基因家族而言，这并不是一个问题，但miRNA基因的数量仍不明确。我们所使用的探针集是基于miRBase设计的。 ⁸ 2006年10月发布9.0版。来自近期研究 ^{9, 10}显然，该探针组已涵盖丰度最高且生物学意义最重要的哺乳动物miRNA。

进行定制微阵列实验没有重大的技术难题。根据我们的经验，微阵列实验成功的关键在于：1）获得打印质量良好的芯片，2）制备高质量且足量的RNA，以及3）杂交后正确地洗涤芯...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NCode 多物种miRNA微阵列探针组 V2	Invitrogen	MIRMPS201	基于 miRBase Release 9.0（2006年10月）设计。它包含 ˜ 1,140 条未经修饰的、长度为 34-44 nt 的寡核苷酸，用作线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类 miRNA 的探针，以及多种内部对照探针（如 snoRNA）。miRNA 探针为与成熟 miRNA 序列互补的成对序列，因此其大小为 ˜ 44 个核苷酸。在分析时，可重点关注特定基因组中的 miRNA。
Trizol	Invitrogen	15596018	我们还使用了富集的小RNA组分进行标记，尽管总RNA样品更易于制备和定量，且适用于mRNA分析等下游应用。
T4 RNA连接酶1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 核酸标记试剂盒	Invitrogen	U21660	该试剂盒或类似产品也可用于标记实验用RNA样本或对照RNA（而非对照DNA）。
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	定制	小RNA组分可通过连接法进行类似标记。
CentriSep 柱	普林斯顿分离技术公司	CS-901
GAPSII 包被玻片	康宁	40004	也可使用其他类型的载玻片。
微阵列杂交室	康宁	2551 或 40080	其他类型的杂交室和盖玻片也应可用。使用市售的杂交仪可显著缩短杂交时间，例如缩短至 ˜ 2小时。
举升器滑块	赛默飞世尔科技公司	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	安捷伦科技