进行定制化 microRNA 芯片实验

摘要

本文介绍了一种进行定制 microRNA 微阵列实验的简单流程。步骤包括 RNA 的提取、RNA 与参考 DNA 的标记、将样品杂交至微阵列芯片、扫描微阵列、以及杂交信号的定量与分析。

摘要

microRNAs (miRNAs) 是一类庞大的分子家族 ˜ 长度为22个核苷酸（nt）且在真核生物中广泛表达的RNA分子 ¹复杂的基因组编码了至少数百种miRNA，这些miRNA主要在转录后水平抑制大量靶基因的表达 ^{2, 3}miRNA 调控多种多样的生物学过程 ¹此外，miRNA 表达的改变与人类疾病（如癌症）相关，miRNA 可能作为疾病的生物标志物及预后指标 ^{4, 5}因此，了解在多种不同条件下miRNA的表达及其功能显得尤为重要。

目前已有三种主要方法用于miRNA表达谱分析：实时PCR、微阵列和深度测序。miRNA微阵列技术具有高通量、通常成本较低的优点，且大部分实验与分析步骤可在大多数大学、医学院及其附属医院的分子生物学实验室中完成。本文描述了一种定制miRNA微阵列实验的方法。将miRNA探针集打印在玻璃载片上以制备miRNA微阵列。采用能够保留小RNA组分的方法或试剂提取RNA，然后用荧光染料进行标记。作为对照，针对部分miRNA设计的参考DNA寡核苷酸也用另一种荧光染料进行标记。该参考DNA可用于评估载片质量和杂交效果，并用于数据归一化。将标记后的RNA与DNA混合后，杂交至包含数据库中大多数miRNA探针的微阵列载片上。洗涤后，对载片进行扫描以获取图像，并对各个点的荧光强度进行定量。这些原始信号将进一步处理和分析，作为相应miRNA的表达数据。微阵列载片可经剥离后重复使用，以降低微阵列成本并提高实验的一致性。相同原理和操作流程也适用于其他类型的定制微阵列实验。

方案

1. 定制miRNA微阵列的打印

1. 使用大学或公司的基因芯片核心设施服务打印基因芯片载片。基因芯片制备的质量是基因芯片实验成功最关键的要素之一。如果可能，尝试多家服务提供商。理想情况下，应一次性打印50至100张载片，所有载片应外观一致，点样清晰、独立且互不重叠。
2. 对于基因芯片载体，我们使用GAPS II包被的载片。
3. 对于miRNA探针，我们使用NCode多物种miRNA基因芯片探针试剂盒V2。
4. 将所有寡核苷酸溶解于3 × SSC中，浓度为10 μM，并在载片上进行四次重复打印。根据GAPS II载片的说明，通过紫外照射固定探针。使用钻石笔在载片上标记探针打印区域及方向。于22°C保存。

2. 样品制备

1. 只要能够保留小RNA，任何方法或试剂均可用于RNA的提取。我们通常使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，所得RNA的产量和质量均令人满意，可通过A_260nm和A_280nm的吸光度值进行测定。
2. 进行RNA标记时，将约25 μg总RNA与0.5 μg的5'-pCU-DY547-3'⁶混合于1×缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.8，20 mM MgCl₂，10 μg/ml BSA，10% DMSO）中，并加入约20单位的T4 RNA连....

讨论

尽管深度测序技术近年来取得了显著进展，微阵列（microarray）仍然是进行DNA和RNA高通量分析的可行选择。与深度测序相比，微阵列实验成本较低，且典型的分子生物学实验室可在内部完成大部分实验操作和数据分析，从而提高了灵活性并节省了时间。未来，微阵列可能特别适用于对特定基因集合进行深入研究，例如基因组中全部或部分转录因子或miRNA；本文所介绍的基本原理和操作流程同样可用于针对除miRNA外其他基因家族的定制化微阵列实验。当然，微阵列的一个主要局限在于必须事先具备已知的序列信息。 先验的。对于模式生物中的大多数蛋白质编码基因家族而言，这并不是一个问题，但miRNA基因的数量仍不明确。我们所使用的探针集是基于miRBase设计的。 ⁸ 2006年10月发布9.0版。来自近期研究 ^{9, 10}显然，该探针组已涵盖丰度最高且生物学意义最重要的哺乳动物miRNA。

进行定制微阵列实验没有重大的技术难题。根据我们的经验，微阵列实验成功的关键在于：1）获得打印质量良好的芯片，2）制备高质量且足量的RNA，以及3）杂交后正确地洗涤芯.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NCode 多物种miRNA微阵列探针组 V2	Invitrogen	MIRMPS201	基于 miRBase Release 9.0（2006年10月）设计。它包含 ˜ 1,140 条未经修饰的、长度为 34-44 nt 的寡核苷酸，用作线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类 miRNA 的探针，以及多种内部对照探针（如 snoRNA）。miRNA 探针为与成熟 miRNA 序列互补的成对序列，因此其大小为 ˜ 44 个核苷酸。在分析时，可重点关注特定基因组中的 miRNA。
Trizol	Invitrogen	15596018	我们还使用了富集的小RNA组分进行标记，尽管总RNA样品更易于制备和定量，且适用于mRNA分析等下游应用。
T4 RNA连接酶1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 核酸标记试剂盒	Invitrogen	U21660	该试剂盒或类似产品也可用于标记实验用RNA样本或对照RNA（而非对照DNA）。
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	定制	小RNA组分可通过连接法进行类似标记。
CentriSep 柱	普林斯顿分离技术公司	CS-901
GAPSII 包被玻片	康宁	40004	也可使用其他类型的载玻片。
微阵列杂交室	康宁	2551 或 40080	其他类型的杂交室和盖玻片也应可用。使用市售的杂交仪可显著缩短杂交时间，例如缩短至 ˜ 2小时。
举升器滑块	赛默飞世尔科技公司	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	安捷伦科技