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用于心脏组织工程的纤维蛋白水凝胶包封心肌细胞

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DOI：

10.3791/3251

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2011年9月19日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University

本文内容

摘要

我们描述了新生大鼠心肌细胞的分离方法，以及将细胞包封于纤维蛋白水凝胶支架中用于组织工程的制备步骤。我们还介绍了培养结束后对组织工程心肌组织的分析方法，包括电刺激下产生的主动收缩力、细胞活力检测以及免疫组织化学染色。

摘要

在三维水凝胶环境中培养细胞是组织工程构建体开发以及体外研究细胞在不同培养条件下反应的重要技术。由于在各个维度上施加了机械和化学刺激，三维环境能更接近地模拟细胞在体内所经历的情况1。三维水凝胶可由合成聚合物（如PEG-DA2和PLGA3）制成，也可由多种天然存在的蛋白质制成，例如胶原蛋白4、透明质酸5或纤维蛋白6,7。由纤维蛋白（一种天然存在的血液凝固蛋白）制备的水凝胶可聚合形成网格结构，参与机体自然的伤口愈合过程8。纤维蛋白可被细胞降解且具有潜在自体来源的可能性9，使其成为组织工程中理想的临时支架。

本文详细描述了从出生三天的大鼠幼崽中分离新生心肌细胞，并将这些细胞制备成用于组织工程中纤维蛋白水凝胶结构包封的步骤。新生心肌细胞是体外研究心肌组织形成与工程中常用的细胞来源4。纤维蛋白凝胶通过将纤维蛋白原与凝血酶混合而形成。凝血酶切割纤维蛋白原中的纤维蛋白肽FpA和FpB，暴露出可与其他单体相互作用的结合位点10。这些相互作用促使单体自组装成纤维，进而形成水凝胶网络。由于该酶促反应的时间可通过调节凝血酶与纤维蛋白原的比例，或钙离子与凝血酶的比例进行调控，因此可制备出具有多种不同几何形状的注射成型结构11,12。此外，我们还可通过在培养过程中对凝胶施加约束的方式，引导所形成的组织产生定向排列13。

在静态条件下培养工程化心肌组织构建物两周后，心肌细胞已开始重塑该构建物，并能在电刺激条件下产生收缩力6。作为本实验方案的一部分，我们还描述了培养结束后对组织工程心肌的分析方法，包括通过电刺激评估心肌组织构建物产生的主动收缩力的功能分析，以及检测最终细胞活力的方法（活-死细胞染色实验），并采用免疫组织化学染色来观察对收缩功能至关重要的典型蛋白（如肌球蛋白重链，Myosin Heavy Chain 或 MHC）以及心肌细胞间耦联相关蛋白（连接蛋白43，Connexin 43 或 Cx43）的表达与形态。

方案

1. 新生儿心肌细胞分离——准备（前一天）

本部分配制的溶液：PBS-葡萄糖溶液、终止培养基。

  1. 配制 PBS-葡萄糖溶液：将 5 mL 青霉素-链霉素溶液（青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 μg/mL）和 1.98 g 葡萄糖加入 250 mL 1× 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，再用额外的无菌 1× PBS 定容至 500 mL。
  2. 配制终止培养基：将 25 mL 胎牛血清（FBS）和 5 mL 青霉素-链霉素溶液（浓度同上）加入 250 mL 无菌 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，再用无菌 DMEM 定容至 500 mL，随后通过 0.2 微米滤膜进行无菌过滤。
  3. 通过高压灭菌法对分离所需手术器械进行灭菌处理：包括止血钳、#5 镊子、大剪刀、显微剪刀和手术刀柄（#4）。

2. 新生大鼠心肌细胞分离——准备阶段（收获当天）

务必保持无菌

本部分使用的溶液：PBS-葡萄糖溶液、碘伏

  1. 每窝仔鼠准备两个无菌的 100 mm 培养皿，放入超净台中，并各加入约 10 mL 冰冷的 PBS-葡萄糖溶液。随后将培养皿置于装有冰块的冰桶中，放置于无菌培养超净台内。
  2. 将一个装有 30–40 mL 聚维酮碘（Betadine）的 250 mL 烧杯放入超净台中。
  3. 每窝加入 50 mL PBS-葡萄糖溶液至瓶中，密封后放入 37°C 水浴中预热。
  4. 每位操作人员在超净台工作台面上铺一张吸水性实验垫巾，并在其上覆盖一张无菌洞巾，注意避免触碰洞巾中央的无菌操作区域。将手术器械和一块 4 × 4 纱布垫倒置于无菌洞巾上，注意勿用手套接触器械。打开无菌 #20 手术刀片并倒置于洞巾上，同样注意避免用非无菌手套接触。
  5. 将仔鼠从母鼠身边取出，放入不透明容器中，随后转移至超净台内。
  6. 戴上无菌手套
  7. 将纱布折叠成四层，用止血钳夹住，放入聚维酮碘（Betadine）烧杯中浸泡。
  8. 将手术刀片安装至刀柄上，放置一旁备用。

3. 新生儿心肌细胞分离 - 心脏解剖

本部分使用的溶液：Betadine、PBS-葡萄糖溶液

  1. 用非优势手的拇指和食指捏住幼鼠肩胛骨之间的皮肤将其提起。使用大剪刀一次性切断幼鼠头部。务必从幼鼠背部向前剪，以确保脊柱完全切断。
  2. 用浸有碘伏的纱布擦拭幼鼠胸部。通过捏紧肩胛骨固定幼鼠，进行部分开胸以暴露心脏。增加施加的压力，使心脏突破肋骨以便进行肩胛部解剖。
  3. 将手术刀片从心脏后方穿过，切断大血管并取出心脏。将取出的心脏置于盛有冰上预冷的PBS-葡萄糖溶液的培养皿中。
  4. 对同窝的每只幼鼠重复步骤1–3。

4. 新生儿心肌细胞分离 - 心肌细胞分离

本部分配制/使用的溶液：PBS-葡萄糖溶液、胶原酶溶液、终止液

  1. 心脏分离后，用预冷的 PBS 葡萄糖溶液冲洗，去除残留血液和结缔组织；切除心脏顶部的 1/3，仅保留心室组织，并将其放入先前准备好的含预冷 PBS 葡萄糖溶液的新培养皿中。
  2. 使用显微剪刀和镊子小心地将心脏组织切成约 1 立方毫米大小的碎块。
  3. 取一支无菌移液管，用剪刀剪去管尖，使管口直径约为 3 mm。用该移液管将组织碎片及全部液体转移至 50 ml 锥形管中，并置于冰上。
  4. 根据每窝仔鼠 15,000 单位的量称取 II 型胶原酶（单位/毫克因批次而异），加入之前预热至 37°C 的 PBS-葡萄糖溶液瓶中，配制胶原酶溶液。充分混匀后，经无菌滤器过滤至另一洁净瓶中，再放回 37°C 水浴中。同时将终止液也放入 37°C 水浴中预热。
  5. 让剪碎的组织在离心管中自然沉降至管底，吸除上清液，直至总体积约为 10 mL。向离心管中加入 7 ml 胶原酶溶液。
  6. 将含有组织碎片和胶原酶的锥形管置于 37°C 培养箱或烘箱内的轨道摇床上的试管架中，开启摇床，转速调至约 60 rpm，关闭门。设定计时器为 7 分钟。注意将胶原酶溶液使用后立即放回水浴中保温。
  7. 计时结束后，将锥形管移回生物安全柜中，同时将预热的胶原酶溶液和终止液也移入柜内。轻柔吹打组织碎片 5–7 次以进一步分散组织。吹打后静置 2–3 分钟，使组织碎片重新沉降。小心吸除尽可能多的上清液，注意避免吸走组织碎片。随后向残留组织中加入 7 ml 新鲜胶原酶溶液，再次放回摇床培养箱中消化 7 分钟。
  8. 在后续每一轮消化中，均轻柔吹打 10 次以分散组织。待组织沉降后，吸出上清液，并用另一支移液管将其收集至另一个 50 ml 锥形管中。向残留组织中再加入 7 ml 胶原酶溶液，继续在摇床上消化 7 分钟。每次收集上清液后，立即向该上清液管中加入 10 mL 终止液（使用不同的血清学移液管操作）。
  9. 重复上述步骤，直至胶原酶溶液全部用完（共 7 步）。
  10. 最后一次消化完成后，将含有细胞的锥形管用 70 μm 细胞筛过滤，收集滤液至新的锥形管中。
  11. 以 100g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 20 mL DMEM 培养基中，混匀后置于冰上，准备使用血细胞计数板进行细胞计数。
  12. 取 50 μl 细胞悬液加入 Trypan Blue 溶液（75 μl Trypan Blue + 125 μl PBS）中，充分混匀后取 10 μl 加入血细胞计数板进行计数。活细胞呈无色透明，死细胞染成蓝色。每只新生大鼠仔鼠预计可获得约 300 万个细胞，细胞活力约为 80–90%。

5. 制备纤维蛋白凝胶构建物——纤维蛋白凝胶制备前的准备工作（需提前充分准备）

本节制备的溶液：纤维蛋白原储备液、凝血酶储备液、普鲁尼克溶液、心肌构建物培养基。

  1. 通过在37°C下数小时内缓慢将纤维蛋白原加入20 mM HEPES缓冲的0.9%生理盐水中，制备33 mg/mL的纤维蛋白原储备液。将溶液在2–8°C下静置过夜。将溶液升温至37°C。使用一系列连续滤器对溶液进行无菌过滤：40 μm细胞筛、带玻璃预滤器的0.45 μm瓶顶滤器，以及带玻璃预滤器的0.2 μm瓶顶滤器。将溶液分装为1 mL和3 mL等份，储存于-20°C。
  2. 通过将500 U凝血酶加入18 mL 0.9%生理盐水和2 mL无菌去离子水中，制备25 U/mL的凝血酶储备液，经0.2 μm滤器无菌过滤后，分装为500 μl和250 μl等份，于-80°C冷冻保存。
  3. 通过将50 g Pluronics F-127溶解于700 mL去离子水中制备5% w/v的Pluronics F-127溶液。再用额外的去离子水定容至1 L。使用0.2 μm滤器进行无菌过滤。若每次使用后均重新无菌过滤，该Pluronics溶液最多可使用三次。
  4. 通过向DMEM中添加10%马血清、2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和6 mg/mL ε-氨基己酸制备心肌构建体培养基。在喂养前需立即加入50 μg/ml抗坏血酸和2 μg/ml胰岛素（溶于25 μM HEPES中）。
  5. 通过组装一根聚四氟乙烯（PTFE）棒、一个PTFE套管、两个为注射目的切去缺口的PTFE垫圈以及两个橡胶O型圈来组装心轴（见图2a）。使用前进行高压灭菌。
  6. 取6 cc注射器外壳作为模具外层部分，3 cc注射器外壳作为活塞使用，并通过切除鲁尔锁端并进行高压灭菌来准备（见图2a）。

6. 制备纤维蛋白凝胶构建物 - 制备纤维蛋白凝胶（在制备纤维蛋白凝胶构建物之前立即进行）

本部分使用的溶液：Pluronics 溶液

  1. 使用 0.2 μm 滤器在使用前对 5% Pluronics F-127 溶液进行无菌过滤。将芯轴和注射器外壳放入生物安全柜中盛有 5% Pluronics 溶液的 1 L 烧杯内。在生物安全柜中浸泡部件 2–3 小时，以确保完全包被。Pluronics 溶液可包被芯轴，防止纤维蛋白凝胶黏附于芯轴表面。
  2. 经过 2–3 小时孵育后，将 5% Pluronics 溶液倒回原瓶中，在生物安全柜操作台面上铺置无菌铺巾，并佩戴无菌手套进行模具组装。
  3. 将组装好的芯轴插入 6 cc 注射器外壳中，使用 3 cc 注射器作为活塞，确保 O 形圈与聚四氟乙烯垫片之间形成紧密密封。

7. 通过注塑成型法制备纤维蛋白凝胶构建物

本部分配制的溶液：F 溶液、T 溶液、细胞溶液。

  1. 制备 1 mL 纤维蛋白凝胶（最终纤维蛋白原浓度为 3.3 mg/mL，最终凝血酶浓度为 25 U/mL），在锥形管中配制 F 溶液：将 112 μL 纤维蛋白原储备液加入 558 μL 含 0.9% 氯化钠的 20 mM HEPES 缓冲液中。另取一个锥形管，配制 T 溶液：将 17 μL 凝血酶储备液和 1.3 μL 2 N Ca++ 溶液加入 135 μL DMEM 中。参见表 1。
  2. 在第三个锥形管中，通过离心收集细胞，并将细胞重悬于一定体积的溶液中，使细胞浓度达到 2940 万细胞/mL，即最终构建物中所需细胞浓度的 6 倍。
  3. 当准备浇铸纤维蛋白凝胶构建物时，准备一支带有 18G、1½ 英寸长针头的 1 mL 注射器，并另备一支 21G、1 英寸长的针头备用。
  4. 纤维蛋白溶液按 F 溶液 : T 溶液 : 细胞溶液 = 4:1:1 的比例配制。配制 1 mL 凝胶时，先将 667 μL F 溶液加入洁净的 50 mL 离心管中，随后加入 167 μL 细胞溶液，最后加入 167 μL T 溶液。用移液器轻轻混匀，注意避免引入气泡。溶液混合后反应即开始，应立即进行构建物注射。
  5. 取预先准备好的带 18G 针头的注射器吸取纤维蛋白溶液。操作时注意不要倒置注射器，以防气泡进入针头。将 18G 针头更换为 21G 针头，轻轻轻敲注射器以排出空气泡。
  6. 将注射器沿聚四氟乙烯 O 形圈的凹槽插入模具的塞子与外壳之间，将溶液注入模具中。将模具倾斜，使凹槽朝上，以确保完全填充。取出注射器后继续填充其余模具。可同时制备足够填充多个模具的凝胶溶液，但由于溶液凝固迅速，通常建议每次注射的构建物数量不超过 6 个。
  7. 将模具每三个一组用 Parafilm 封口膜包裹，置于 37°C 培养箱或烘箱中。让凝胶在模具中孵育 20 分钟，使其充分聚合。
  8. 每个培养罐（Nalgene 直壁罐）中按每构建物 21 mL 加入心肌构建物培养基。使用无菌的 3 cc 注射器外壳作为推杆，将带有构建物的芯棒推入含 DMEM 的大培养皿中，然后将构建物转移至样品罐中。每个 16 盎司罐最多可容纳 6 个构建物，每个 4 盎司罐可容纳 2 个。
  9. 将罐盖拧紧后转移至培养箱中。在培养箱内，将罐盖略微松开，以利于气体交换。
  10. 24 小时后，使用无菌牙科探针将构建物从环形模具两端的白色聚四氟乙烯 O 形圈上轻轻推开，以确保构建物均匀对齐（参见代表性结果中的图 2）。

8. 分析技术（培养2周后）—收缩力测试

本部分使用的溶液：DMEM、心肌构建物培养基。

  1. 将刺激器引线上的鳄鱼夹夹在浴槽电极的导线上。启动数据采集板、脉冲发生器和力传感器。将力传感器切换至5g档位并调零。打开一个自定义的LabView程序，用于显示和保存力传感器的数据。在数据文件夹中为每个样本创建一个新的空白文本文件。
  2. 将DMEM放入37°C水浴中，并在测试构建物前留出足够时间使其升温。升温后，将37°C的DMEM加入到力测量系统的介质浴中（见图3A）。
  3. 用镊子轻轻将构建物环从聚四氟乙烯支撑架上滑下，从样品瓶中取出构建物，并将其套在力测量系统介质浴中的固定金属柱上。切勿用镊子夹持构建物！应使用镊子推动并抬起构建物，使其脱离芯轴支撑。
  4. 将构建物的另一端套在传感器臂上，并拧紧，直至传感器读数为0.50V（约1.0克力或10毫牛顿张力）。
  5. 选择用于记录收缩力数据的文本文件。
  6. 在心脏刺激器（型号 # S88X，Grass Technologies）上，将脉冲电压设为20V（8 V/cm），持续时间为6ms，频率为1 Hz。
  7. 按下“输出开/关”按钮，开始电刺激起搏。
  8. 开始记录，直至波形趋于稳定规律。
  9. 小心地将构建物从力测量系统的介质浴中取出，并放回培养基中。然后将力测量系统介质浴中的DMEM移除，并更换为新鲜温热的DMEM，以便分析其他样本。
  10. 剪开构建物并将其展开，以便测量其长度和宽度。
  11. 将构建物切成若干片段，用于后续分析检测，包括活力检测、组织学分析或Western blot检测。

9. 培养两周后的分析技术 - 使用Invitrogen Live/Dead Assay进行活/死细胞染色以评估细胞活力（Live-Dead Assay）14：

本部分使用的溶液：EthD-1 储存液、calcein AM 储存液、PBS

  1. 用 PBS 清洗样品，每次 5 分钟，共清洗 3 次。
  2. 将 20 μl 的 2 mM EthD-1 储存液加入 10 mL 无菌 PBS 中，并涡旋振荡以确保充分混匀。
  3. 向 EthD-1 溶液中加入 5 μl 的 4 mM calcein AM 储存液，再次涡旋振荡以确保充分混匀。
  4. 加入足量上述溶液以完全覆盖构建物。
  5. 避光孵育（防止染料光漂白），室温下孵育 30 分钟。
  6. 移除染料并替换为预温的 PBS。使用荧光显微镜观察并记录图像。Calcein 由 494 nm 光激发，发射 517 nm 光；乙啶同二聚体-1（ethidium homodimer-1）由 528 nm 光激发，发射 617 nm 光。样品结果见图 4。

10. 培养两周后的分析技术 - 心肌细胞重要蛋白的免疫组织化学染色：

本部分使用的溶液：PBS、PBS 中的 4% 多聚甲醛、PBS 中的 5% 驴血清、PBS 中的抗体、PBS 中的 0.1 ng/mL Hoechst 33258。

  1. 用 PBS 进行 3 次、每次 5 分钟的洗涤，冲洗样本。
  2. 用含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液在 4°C 下固定样本，固定时间为 2–3 小时。
  3. 用 PBS 进行 3 次、每次 5 分钟的洗涤，冲洗样本。
  4. 样本现在可根据所选方案进行包埋、切片和染色。本方案剩余部分介绍用于共聚焦显微镜成像的整体结构染色。请注意，由于抗体需要更长时间扩散进入整体结构，因此孵育时间比切片组织更长。此外，所有后续步骤均在室温下进行。
  5. 向样本中加入含 0.1% Triton-X 的 PBS，作用 30 分钟，以通透细胞膜。
  6. 用 PBS 进行 3 次、每次 10 分钟的洗涤，冲洗样本。
  7. 向样本中加入含 5% 驴血清的 PBS，封闭 1½ 小时，以阻断二抗与样本的非特异性结合。
  8. 向样本中加入 Connexin 43（1:50 稀释）和 Myosin Heavy Chain（1:100 稀释）的一抗抗体 PBS 溶液，孵育 3 小时。若要连续标记两种蛋白，必须确保一抗来自不同宿主（例如兔和小鼠）。
  9. 用 PBS 进行 3 次、每次 10 分钟的洗涤，冲洗样本。
  10. 加入适当荧光标记的二抗 PBS 溶液，孵育 3 小时。
  11. 用 PBS 进行 3 次、每次 10 分钟的洗涤，冲洗样本。
  12. 在共聚焦显微镜成像前，加入含 0.1 ng/mL Hoechst 33258 的 PBS，孵育 15 分钟。
  13. 用 PBS 进行 3 次、每次 10 分钟的洗涤，冲洗样本。
  14. 通过共聚焦显微镜观察细胞，分析样本中 MHC 和 Cx43 的表达情况（示例结果见图 4）。

11. 代表性结果 / 结果：

心肌细胞纤维蛋白构建物最初覆盖模具的整个宽度（图2B）。构建物中不应存在气泡，且在整个长度上应呈现均匀外观。培养两周后，构建物收缩至初始宽度的约1/4（图2C）。

当在我们定制的收缩力装置（图 3A）中对构建物进行电刺激 pacing 时，可生成如图 3B 所示的单收缩力数据。该波形可在 MATLAB（MathWorks）中单独分析，以确定收缩力、收缩速率和舒张速率。预期的单收缩力约为 1.3 mN6。

由于氧气向构建物内部扩散受限，构建物的细胞活力与其深度相关。在构建物表面（图4A），可观察到较高的细胞活力。通过共聚焦显微镜观察（图4B），可见构建物具有排列有序的结构，其中肌球蛋白重链（MHC，显示为红色）对收缩功能至关重要。连接蛋白43（Connexin 43，显示为绿色）则是心肌细胞间耦联所必需的。

心肌细胞分离流程图；流程：分离、构建培养、DNA检测、组织学分析。
图1： 包封过程概览

``` 层析装置，包含色谱柱和环；蛋白质分离实验；实验室设备。 ```
图 2： A) 用于制备纤维蛋白凝胶的独立及组合模具部件。从左至右：两个聚四氟乙烯垫圈、两个硅胶O型圈、一根聚四氟乙烯棒、一根聚四氟乙烯管、一个组装完成的芯轴、芯轴的外筒以及推杆。B) 从外筒中脱模后立即构建的结构（第0天）。C) 经13天培养后在模具上压紧的构建物（红色箭头所示）。

带有传感器的力测量装置；力随时间变化的图表，图中显示重复出现的峰值。
图 3： A) 用于记录单次收缩力的定制化收缩力测量系统。该系统通过带有支柱的力传感器测量收缩力，并将结果输出至计算机。含有两个带导线碳电极的浴槽连接至电刺激器，用于对构建物进行起搏。两个支柱用于固定构建物。B) 在0.5 Hz电刺激下生成的单次收缩力波形示例数据。

细胞结构的荧光显微镜图像；A：绿色染色的组织；B：红色纤维，蓝色细胞核。
图 4： A) 构建物第13天的活/死细胞染色检测（比例尺 = 400 μm）。绿色代表活细胞，红色代表死细胞。B) 肌球蛋白重链（红色）、连接蛋白43（绿色）和Hoechst细胞核染色（蓝色）的共聚焦图像（比例尺 = 10 μm）。

F 溶液T 溶液细胞溶液
纤维蛋白原112 μl凝血酶17 μlDMEM 中的细胞170 μl
HEPES558 μlCa++1.3 μl  
  DMEM152 μl  
总计670 μl总计170 μl总计170 μl

表1. 纤维蛋白凝胶溶液，配制1 mL凝胶所需用量。
注：纤维蛋白原 = 33 mg/mL 纤维蛋白原溶于20 mM HEPES缓冲盐水
HEPES = 20 mM HEPES缓冲盐水
凝血酶 = 25 U/mL 溶于0.81% NaCl溶液
Ca++ = 2 N 氯化钙溶液

讨论

将新生大鼠心肌细胞包封于纤维蛋白凝胶中，可获得一种稳定且具有活性的三维体外心肌系统模型。纤维蛋白是一种优选的生物材料，因为当细胞被包埋后，仍保持代谢活性，并能够发生收缩、重塑并重建与天然心肌组织一致的细胞外基质12。由于在此环境中允许心肌细胞自行排列，其功能特性更接近于心肌组织，与各向同性组织相比可产生更大的收缩力6。对于潜在的治疗应用而言，必须将细胞包封于一种既能维持细胞活性又能支持其功能发挥的材料中。本文所展示的实验方案提供了一种高效且精确的方法，用于构建纤维蛋白网络，以调控三维微环境中心脏细胞的行为。

在构建和培养这些组织工程结构的过程中，可能会出现一些潜在问题。其中一个潜在问题是细胞在包埋前的存活率维持，这将显著影响结构的功能性。应尽量减少细胞在分离后到包埋入纤维蛋白凝胶前的时间，以降低细胞死亡。应严格按照每隔一天更换一次培养基的频率为结构提供营养。此外，确保所用溶液的均一性也至关重要。如果纤维蛋白原、凝血酶和细胞的混合物产生非均质环境，则细胞重塑细胞外基质、力学耦合及收缩的能力可能受到阻碍。同时，在注射构建物时应避免产生气泡，以防止对工程化组织连续性的干扰。解决此问题的一种方法是吸取比所需量更多的凝胶至注射器中，并缓慢注射。最后，一旦纤维蛋白基质成型并在培养基中培养24小时后，必须将构建物从环形模具的侧壁上分离，以促进细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩。将构建物保持在模具中央有助于气体和营养物质的交换。若构建物黏附于模具侧壁，还可能破坏细胞的理想排列方向。

需要注意的是，本方案中采用清醒状态下断头法作为安乐死方法，该方法符合美国国立卫生研究院和美国兽医协会指南的规定。然而，部分机构建议对新生大鼠先使用麻醉剂再进行断头。我们选择在清醒状态下断头，是为了确保离体心脏组织/细胞处于缺氧环境的时间最短。相对轻微的缺氧即可导致心肌细胞缺血，甚至可能引起心肌细胞死亡，这会显著影响本方案的实验结果。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院-国家心、肺与血液研究所（资助号：R00HL093358，授予 L.D.B.）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Sigma-AldrichS7653PBS
氯化钾Sigma-AldrichP9333PBS
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS7907PBS
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5655PBS
葡萄糖Sigma-AldrichG5400分离
止血钳Fine Science Tools91308-12分离
精细镊子Fine Science Tools11251-20分离
大剪刀Fine Science Tools91401-14分离
显微剪刀Fine Science Tools91501-09分离
手术刀柄Fine Science Tools10008-13分离
手术刀片Fisher Scientific08-918-5A分离
吸水实验台垫VWR international56617-014分离
无菌手术单Fisher ScientificGM42526分离
高压灭菌袋Fisher Scientific01-812-54分离
纱布垫Fisher Scientific13-761-52分离
聚维酮碘Purdue Products L.P.67618-150-01分离
无菌手套Fisher Scientific19-020分离
无菌移液管Fisher Scientific9962分离
胶原酶Worthington BiochemicalCLS2分离
特氟龙棒，直径1/4英寸McMaster-Carr8546K11模具部件
特氟龙管，内径1/4英寸，外径1/2英寸McMaster-Carr8547K31模具部件
硅胶O型圈，内径1/4英寸，外径1/2英寸McMaster-Carr9396K204模具部件
特氟龙管，内径1/4英寸，外径5/16英寸McMaster-Carr52355K14模具部件
Kendall monoject 注射器，6 ccFisher Scientific05-561-41模具部件
BD 注射器，3 ccFisher Scientific309585模具部件
牛纤维蛋白原Sigma-AldrichF8630构建
牛凝血酶Sigma-AldrichT7513构建
1 M HEPESSigma-AldrichH0887构建
氯化钠Sigma-AldrichS7653构建
DMEMInvitrogen10569构建
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443构建
氯化钙Sigma-Aldrich383147构建
0.2 微米滤器Fisher ScientificSCGVT05RE构建
40 微米细胞筛Fisher Scientific22-363-547构建
0.45 微米瓶顶滤器Corning430627构建
玻璃预滤器EMD MilliporeAP2007500构建
18G，1 1/2 英寸长针头Fisher Scientific14-826-5D构建
21G，1 英寸针头Fisher Scientific14-826C构建
构建用玻璃罐Fisher Scientific2116构建
青霉素-链霉素Invitrogen15140培养基
马血清Sigma-AldrichH1138培养基
胎牛血清Invitrogen16000培养基
氨基己酸Acros Organics103305000培养基
抗坏血酸Sigma-AldrichA5960培养基
胰岛素Sigma-AldrichI9278培养基
多聚甲醛，16%Electron Microscopy Sciences15710组织学
最佳切割温度（OCT）包埋剂Ted Pella, Inc.27050组织学
2-甲基丁烷Fisher Scientific03551-4组织学
小鼠MYH1/2/4/6一抗Santa Cruz Biotechnology, Inc.SC-32732组织学
兔Connexin 43一抗Cell Signaling Technology3512组织学
Dylight 549标记的驴抗小鼠二抗Jackson ImmunoResearch715-505-151组织学
Dylight 488标记的驴抗兔二抗Jackson ImmunoResearch711-485-152组织学
活/死细胞检测试剂盒InvitrogenL-3224分析

参考文献

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