利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

摘要

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用带有细胞外基质核心的水凝胶微柱开发微组织工程化神经网络的方法。接种的神经元聚集体附着后延伸出突起，并形成结构化的神经网络，有助于推动神经发育和神经治疗研究的进展。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 琼脂糖水凝胶（微型组织工程神经网络（micro-TENNs）的无细胞组分）的制备

1. 琼脂糖溶液的制备
   1. 在生物安全柜内，将20 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）转移至两个10 cm培养皿中，以准备微柱的储液槽。使用热珠灭菌器对精细镊子和微型手术刀进行灭菌。
   2. 称取3 g琼脂糖，并转移至生物安全柜内的无菌烧杯中。加入100 mL DPBS，得到终浓度为3%（重量/体积，w/v）的溶液。放入一根洁净的磁力搅拌子，并用铝箔覆盖烧杯。
   3. 使用加热板/搅拌器将烧杯加热至100 °C，并以120–200 rpm的速度搅拌，直至琼脂糖完全溶解（溶液将由浑浊变为透明）。之后继续加热和搅拌，以防止凝胶化，并根据需要调节加热温度，避免琼脂糖烧焦。
      注意：激光切割装置和毛细管两种制备方法分别在下文的1.2和1.3小节中介绍。完成任一小节所述步骤后，请继续进行1.4小节。对于两种微柱制备方法，均需迅速加入液态琼脂糖，因为琼脂糖在冷却时会快速凝固。在后续任何步骤中若需使用高压灭菌锅进行灭菌，请采用适用于玻璃器皿的标准条件。
2. 使用激光切割装置制备微柱
   注意：激光切割装置由透明丙烯酸材....

结果

图1：用于制造激光切割微柱的装置蓝图及用于细胞聚集的3D打印金字塔形微孔模具。 （A）-（B）用于制造水凝胶微柱的圆柱形通道阵列的底半部分和顶半部分的蓝图及图像。（C）用于固定装置的端盖的蓝图及图像。前后两部分具有相同的尺寸。（D）组装完成的微柱制造装置图像。仅将两个端盖和底半部分通过下部两个对准孔用螺丝夹紧（左图）。虚线表示针灸针穿过每个端盖上的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
激光切割机	Universal laser systems	PLS4.75	用于制作激光切割微通道模具。
激光切割微柱制备装置	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和设计图纸已在论文中提供。
螺丝	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为 3.05 mm
螺母	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为 3.05 mm
针灸针（180 µm 直径）	Lhasa medical	sj.16X40	可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿	Fisher	08772B
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14200075
一次性聚苯乙烯血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
毛细管（398 µm 直径）	Fisher	21170D	可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
加热板	Fisher	SP88857200
磁力搅拌子	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 号规格针头	Fisher	14-826-49
微型手术刀	Roboz surgical	RS-6270
剪刀	Fine science tools	14081-09
镊子	World precision instruments	501985
热珠灭菌器	Sigma	Z378550-1EA
体视显微镜	Nikon	SMZ800N	用于所有解剖步骤及微-TENN 的制备。
大鼠尾部 I 型胶原蛋白	Corning	354236	保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232	保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
神经基础培养基	Invitrogen	21103049	用于胎前和胚胎神经元细胞培养的基础培养基。储存于 4ºC，使用前在 37 ºC 预热。
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸（HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen	14170112	储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma	10104159001	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 添加剂	Invitrogen	12587010	添加至神经基础培养基中，用于海马和皮层神经元的培养。储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	Strain 001
巴斯德移液管	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋振荡器	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
Objet30 3D 打印机	Stratasys	--------------	用于制作锥形微孔模具。
3D 打印锥形微孔模具	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和设计图纸已在论文中提供。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）及固化剂	Fisher	NC9285739	以试剂盒形式提供，包含弹性体和固化剂。需在化学通风橱内操作。
漏斗	Fisher	10-348C
1 mL 移液球	Sigma	Z509035
微型刮勺	Fisher	S50821
12 孔细胞培养板	EMESCO	1194-353043
烘箱	Fisher	11-475-154
培养箱	Fisher	13 998 076
Eclipse Ti-S 显微镜	Nikon	--------------	用于拍摄相差图像。配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01 版本）进行数字图像采集。