利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

摘要

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用带有细胞外基质核心的水凝胶微柱开发微组织工程化神经网络的方法。接种的神经元聚集体附着后延伸出突起，并形成结构化的神经网络，有助于推动神经发育和神经治疗研究的进展。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 琼脂糖水凝胶（微型组织工程神经网络（micro-TENNs）的无细胞组分）的制备

1. 琼脂糖溶液的制备
   1. 在生物安全柜内，将20 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）转移至两个10 cm培养皿中，以准备微柱的储液槽。使用热珠灭菌器对精细镊子和微型手术刀进行灭菌。
   2. 称取3 g琼脂糖，并转移至生物安全柜内的无菌烧杯中。加入100 mL DPBS，得到终浓度为3%（重量/体积，w/v）的溶液。放入一根洁净的磁力搅拌子，并用铝箔覆盖烧杯。
   3. 使用加热板/搅拌器将烧杯加热至100 °C，并以120–200 rpm的速度搅拌，直至琼脂糖完全溶解（溶液将由浑浊变为透明）。之后继续加热和搅拌，以防止凝胶化，并根据需要调节加热温度，避免琼脂糖烧焦。
      注意：激光切割装置和毛细管两种制备方法分别在下文的1.2和1.3小节中介绍。完成任一小节所述步骤后，请继续进行1.4小节。对于两种微柱制备方法，均需迅速加入液态琼脂糖，因为琼脂糖在冷却时会快速凝固。在后续任何步骤中若需使用高压灭菌锅进行灭菌，请采用适用于玻璃器皿的标准条件。
2. 使用激光切割装置制备微柱
   注意：激光切割装置由透明丙烯酸材料通过商用CO₂激光切割机制成。激光切割技术在多种工程与科研应用中已有充分记录。该模具（图1）包含五个圆柱形通道阵列，每个通道直径为398 µm，长度为6.35 mm。这些圆柱形阵列由两部分沿长度方向构成：下半部分（长：25.4 mm，宽：6.35 mm，高：6.0 mm）和上半部分（长：31.5 mm，宽：6.35 mm，高：12.7 mm），如图1A和图1B所示。前后端盖（图1C，长：31.5 mm，宽：6.35 mm，高：12.7 mm）可通过夹紧将两部分固定在一起，端盖上有四个对齐孔，分别与上下两部分各两个孔对应，通过螺钉拧紧可确保所有部件牢固结合。端盖还设有五个与圆柱通道同心的孔，用于插入针灸针以形成微柱的管腔。
   1. 用铝箔包裹图1所示装置后进行高压灭菌以实现灭菌。如图1D所示，将前后端盖仅与下半部分对齐组装，并使用两个#4-40螺钉和螺母（螺纹直径：3.05 mm）在底部对齐孔中固定三部分。
   2. 将一根针灸针（直径：180 µm，长度：30 mm）完全插入装置前后端盖的针孔中（图1D）。使用移液器将足量液态琼脂糖（约1 mL，用于五个通道）倒入下半部分，使其完全填充每个半圆柱形通道。
   3. 立即将装置的上半部分置于下半部分之上，并施加压力直至其牢固就位，以完成圆柱形通道的闭合（端盖与上半部分之间的摩擦力可使其保持固定）。琼脂糖加入后，在室温下静置约5分钟，使其在通道内完成凝胶化。
   4. 手动从装置端盖的各个孔中抽出针灸针。拆除螺钉，并手动将两个端盖和上半部分从下半部分上分离，此时下半部分将保留水凝胶微柱。
   5. 使用精细镊子轻轻将微柱从下半部分的通道中取出，并转移至先前准备好的含DPBS的培养皿中（步骤1.1.1）。重复使用该装置进行下一轮微柱制备。继续进行1.4小节。
3. 使用毛细管制备微柱
   1. 将玻璃毛细管（直径：398.78 µm，长度：32 mm）转移至生物安全柜内。手动将长管折断为2.0–2.5 cm的片段，并将一根针灸针（直径：180 µm，长度：30 mm）完全插入每个片段中（图2A）。
   2. 将1 mL液态琼脂糖从烧杯转移至空培养皿表面。手持毛细管及已插入的针灸针，将管的一端接触琼脂糖液滴，通过毛细作用使其填充。轻轻晃动毛细管以促进毛细上升。
      注意：应尽可能利用毛细作用将毛细管填充至最高位置；之后可根据所需长度将这些微柱切割为更小的结构。由于琼脂糖冷却和凝固迅速，1 mL琼脂糖液滴通常仅用于一根毛细管，以避免后续毛细作用受阻。
   3. 当液体停止上升后，将毛细管从液滴中取出，并水平放置于培养皿表面。静置5分钟，使琼脂糖在管内完成凝胶化。
   4. 用拇指和食指分别置于毛细管两侧并施加压力。另一只手迅速抽出针灸针，同时用拇指和食指防止微柱本身滑出毛细管。将一根30号针头插入毛细管，缓慢推动微柱进入含DPBS的培养皿中（步骤1.1.1）。
4. 微柱修整与灭菌
   1. 使用精细镊子将一根微柱从DPBS中轻柔转移至空培养皿中。用移液器在微柱顶部加入10 µL DPBS，以防止干燥。将该培养皿置于体视显微镜下以便观察。
      注意：在整个实验流程中，微柱干燥或脱水是指其结构出现明显皱缩，与通常水合状态下的外观有明显区别。脱水的微柱会牢固附着在培养皿表面，难以移动；而水合状态的微柱在镊子操作后通常会在表面滑动。完全干燥的微柱的相差图像见图3A。
   2. 使用微型手术刀修剪微柱，使其缩短至所需长度（此处为2–5 mm）。使用精细镊子将修剪后的微柱转移至步骤1.1.1中准备的另一含DPBS的培养皿中。
   3. 对每个制备的微柱重复步骤1.4.1和1.4.2。
   4. 在紫外（UV）光下对含DPBS培养皿中的微柱进行1小时灭菌。在添加细胞外基质（ECM）和接种细胞前，将培养皿储存于4 °C。

2. 原代神经元培养与强制细胞聚集法

1. 锥形微孔阵列的制备
   注意：本节使用一种3D打印模具，该模具由一个圆柱形基座（直径：2.2 cm，高度：7.0 mm）和顶部的九个方形锥体（边长：4.0 mm，倾斜角：60°）组成，排列成3×3阵列，如图1E所示。使用市售3D打印机进行增材制造的过程已有充分记录。可使用计算机辅助设计软件设计模具，生成的设计文件随后可被数字转换为3D打印机的加工路径。不同打印机具有不同的技术规格，其设置与操作说明也相应不同。
   1. 使用3/32英寸钻头在10 cm培养皿盖中央打16个孔，呈4×4阵列排列（边长：4 cm，孔间距：1 cm）。在化学通风橱内，使用培养皿底部称取27 g聚二甲基硅氧烷（PDMS）和3 g固化剂（比例为1:10）。用微型刮刀搅拌，使固化剂均匀分散。
   2. 用打孔的盖子盖住PDMS/固化剂混合物。将一根软管一端连接至通风橱的真空接口，另一端插入漏斗茎部（漏斗口直径：10 cm，茎长：3 cm，茎直径：1.5 cm）。
   3. 用3/32英寸钻头在1 mL移液球顶部打一个小孔，将1000 µL微量移液枪头（尖端朝上）插入并固定于该孔中。将移液球和枪头放入软管中，并向上拉紧软管，使移液球密封软管并固定于漏斗茎部。
   4. 将漏斗置于打孔的培养皿盖上，并用合适的稳固支架固定软管。打开真空阀抽气5分钟，使气泡上浮至表面。
   5. 关闭阀门，取下漏斗，并将培养皿在通风橱台面上轻敲约3次，以破裂残留的气泡。
   6. 将锥形微孔3D打印模具逐个放入12孔板的各孔中，锥体朝上。将PDMS/固化剂混合物倒入模具上方，直至填满每孔。用12孔板的盖子盖好，转移至60 °C烘箱中干燥1小时。
   7. 用微型刮刀小心地从板中取出每个PDMS微孔阵列（图1F）。用铝箔覆盖PDMS阵列，并通过高压灭菌进行灭菌。在生物安全柜内，将每个微孔阵列插入12孔板的各孔中（图2B）。
2. 从大鼠胚胎中分离皮层神经元
   1. 在生物安全柜内，向四至六个10 cm培养皿中各加入约20 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（每个解剖组织使用一个培养皿）。将这些培养皿转移至解剖通风橱并置于冰上。使用热珠灭菌器对显微解剖器械（如显微手术刀、剪刀和镊子）进行灭菌。
   2. 将胚胎神经元基础培养基 + 2%无血清添加剂 + 0.4 mM L-谷氨酰胺（下文简称“培养基”）以及0.25%胰蛋白酶 + 1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）预热至37 °C。将脱氧核糖核酸酶（DNase）I在室温下解冻。在HBSS中配制1.5 mL浓度为0.15 mg/mL的DNase I溶液，并将该溶液置于冰上保存。
   3. 通过吸入二氧化碳处死妊娠第18天的大鼠，并通过断头法确认死亡。将尸体转移至无菌解剖通风橱，仰卧放置。用70%乙醇彻底冲洗腹部。
   4. 打开子宫，用剪刀从羊膜囊中取出胚胎（通常约11只），并用镊子转移至含冷HBSS的培养皿中。在体视显微镜下方放置一块预冷（-20 °C）的花岗岩板。将培养皿置于该冷板表面，以在整个解剖过程中维持HBSS的低温。
   5. 通过搅动HBSS清洗幼鼠，然后将其转移至下一个含HBSS的洁净培养皿中。在体视显微镜和解剖器械辅助下，依次分离胚胎的头部、大脑半球和皮层，并在每次解剖后用镊子将组织转移至新的含HBSS的培养皿中。
   6. 仅用巴斯德移液管吸取皮层组织，并将其转移至无菌15 mL离心管中。弃去其他解剖组织。使用移液管依次加入和移除约5 mL HBSS，对皮层组织清洗三次。不使用时将离心管置于冰上。
   7. 用巴斯德移液管将皮层组织转移至含预热胰蛋白酶-EDTA溶液的15 mL离心管中（每5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液处理4–6个皮层）。手动轻摇一次试管，然后置于37 °C环境中。每隔3分钟倒转试管一次，防止组织结块。
   8. 约10分钟后，用巴斯德移液管取出组织并转移至洁净15 mL离心管中，以终止胰蛋白酶作用。用移液管向管中加入0.15 mg/mL DNase I溶液（1.5 mL）。
   9. 用巴斯德移液管手动打碎组织团块，然后涡旋震荡（约30秒），直至溶液呈均一状态且液体中无残留组织碎片。若无法完全均质化，可用巴斯德移液管尖端吸取不可溶的碎片。
   10. 将步骤2.2.9获得的均质细胞溶液在200 × g条件下离心3分钟。用巴斯德移液管小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀的细胞。用移液管加入2 mL培养基，并涡旋震荡以重悬细胞。
   11. 使用血细胞计数板对步骤2.2.10制备的细胞悬液进行计数；预期得率为3.0–5.0 × 10⁶ 个细胞/皮层半球。用培养基配制1 mL或更多的细胞悬液，细胞密度为1.0–2.0 × 10⁶ 个细胞/mL。
3. 神经元细胞聚集体的形成
   1. 用微量移液器将12 µL浓度为1.0–2.0 × 10⁶/mL的细胞悬液加入PDMS阵列的每个微孔中（该阵列已在步骤2.1.7中放入培养板）。
      注意：可根据微柱内径和期望的细胞聚集体大小调整细胞浓度，较高浓度将产生更大的聚集体。
   2. 将培养板在200 × g条件下离心5分钟，促使细胞在微孔底部聚集（图2B）。小心地向每个PDMS阵列上方加入约2 mL培养基，以覆盖所有接种的微孔，注意不要扰动已聚集的细胞。
   3. 将培养板在37 °C和5% CO₂条件下孵育12–24小时。

微型组织工程神经的细胞组分开发

1. 细胞外基质核心的制备
   1. 在完成聚集体孵育后，将I型胶原蛋白和层粘连蛋白加入培养基中（终浓度均为1 mg/mL），置于微量离心管中以配制细胞外基质（ECM）溶液。步骤3.1.2–3.1.4在室温下操作，但当不使用时需将含有ECM的离心管置于冰上，以防止提前凝胶化。
      注意：通常每个微柱（长度：5 mm，内径：180 µm）需要4 µL ECM溶液。
   2. 通过将1–2 µL ECM溶液转移至石蕊试纸上检测初始pH值，并根据需要向ECM中加入1 µL 1 N氢氧化钠（NaOH）和/或1 N盐酸（HCl），反复调节直至pH值达到7.2–7.4。通过上下吹打使ECM溶液充分混匀，同时避免产生气泡。
   3. 使用无菌镊子将步骤1.4.3中的微柱从培养皿转移至空的35 mm或60 mm培养皿中。每次操作4–5个微柱，以防止干燥。将10 µL吸头连接至1,000 µL吸头上，安装于移液器。在体视显微镜下观察，将吸头置于微柱一端，抽吸以去除管腔内的残余DPBS和气泡。
   4. 迅速吸取4–5 µL ECM溶液至移液器中。在体视显微镜下观察，将移液器吸头置于微柱的一端，注入足够量的ECM以充满管腔。确认管腔内无气泡存在，因为气泡可能抑制轴突在ECM中的延伸。若存在气泡，应如步骤3.1.3所述清除ECM后重新添加。
   5. 为防止干燥，于每个微柱周围添加约2 µL ECM溶液。将水凝胶/ECM微柱置于培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育25分钟。孵育结束后立即进行细胞接种。
      注意：步骤3.1.5中的孵育旨在使胶原蛋白和层粘连蛋白在微柱内部完成聚合。
2. 在微柱中接种神经元细胞
   注意：如需更换转导后聚集体的培养基，可倾斜培养板，用移液器吸除附着在孔壁上的培养基，然后沿孔壁缓慢加入约1 mL新鲜培养基（以避免扰动位于锥形微孔中的聚集体）。重复此换液操作一次。
   1. 在完成步骤3.1.5的孵育后，将约10–20 µL培养基转移至放置微柱的培养皿中的两个空白区域。使用移液器将聚集体逐个转移至含有构建物的培养皿中，并用镊子将其移至其中一个小的培养基液滴中，以维持细胞活性。
   2. 在体视显微镜下观察，使用镊子在微柱的两端各插入一个聚集体（用于双向微神经束结构），或仅在一端插入（用于单向结构，视实验设计而定）。通过体视显微镜确认聚集体已正确置于微柱内部。使用镊子将已接种的微柱移至另一小滴培养基中，以防止干燥并维持聚集体的健康状态。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育45分钟，使聚集体牢固黏附于ECM上。通过体视显微镜检查聚集体是否仍位于微柱末端；如发生移位，需重新放置聚集体并重复孵育步骤。
   4. 使用移液管小心地将培养基缓慢加入含有微神经束（micro-TENNs）的培养皿中（35 mm或60 mm培养皿分别加入3 mL或6 mL），直至完全浸没结构。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中进行长期培养。
   5. 每2天进行一次半量换液。使用移液器小心吸除一半旧培养基，并在体视显微镜引导下避免吸走微神经束。缓慢加入预热的新鲜培养基以补充液量。

结果

图1：用于制造激光切割微柱的装置蓝图及用于细胞聚集的3D打印金字塔形微孔模具。 （A）-（B）用于制造水凝胶微柱的圆柱形通道阵列的底半部分和顶半部分的蓝图及图像。（C）用于固定装置的端盖的蓝图及图像。前后两部分具有相同的尺寸。（D）组装完成的微柱制造装置图像。仅将两个端盖和底半部分通过下部两个对准孔用螺丝夹紧（左图）。虚线表示针灸针穿过每个端盖上的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
激光切割机	Universal laser systems	PLS4.75	用于制作激光切割微通道模具。
激光切割微柱制备装置	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和设计图纸已在论文中提供。
螺丝	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为 3.05 mm
螺母	--------------	--------------	#4-40，螺纹直径为 3.05 mm
针灸针（180 µm 直径）	Lhasa medical	sj.16X40	可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿	Fisher	08772B
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14200075
一次性聚苯乙烯血清移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
毛细管（398 µm 直径）	Fisher	21170D	可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
加热板	Fisher	SP88857200
磁力搅拌子	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 号规格针头	Fisher	14-826-49
微型手术刀	Roboz surgical	RS-6270
剪刀	Fine science tools	14081-09
镊子	World precision instruments	501985
热珠灭菌器	Sigma	Z378550-1EA
体视显微镜	Nikon	SMZ800N	用于所有解剖步骤及微-TENN 的制备。
大鼠尾部 I 型胶原蛋白	Corning	354236	保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232	保持在 4 ºC，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
神经基础培养基	Invitrogen	21103049	用于胎前和胚胎神经元细胞培养的基础培养基。储存于 4ºC，使用前在 37 ºC 预热。
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸（HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen	14170112	储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma	10104159001	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 添加剂	Invitrogen	12587010	添加至神经基础培养基中，用于海马和皮层神经元的培养。储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	Strain 001
巴斯德移液管	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋振荡器	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
Objet30 3D 打印机	Stratasys	--------------	用于制作锥形微孔模具。
3D 打印锥形微孔模具	定制	--------------	如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和设计图纸已在论文中提供。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）及固化剂	Fisher	NC9285739	以试剂盒形式提供，包含弹性体和固化剂。需在化学通风橱内操作。
漏斗	Fisher	10-348C
1 mL 移液球	Sigma	Z509035
微型刮勺	Fisher	S50821
12 孔细胞培养板	EMESCO	1194-353043
烘箱	Fisher	11-475-154
培养箱	Fisher	13 998 076
Eclipse Ti-S 显微镜	Nikon	--------------	用于拍摄相差图像。配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01 版本）进行数字图像采集。