设计一种简便的单日工作流程方案用于细菌病原体诊断，可实现对血流感染的快速识别。该方案包含八种临床相关细菌靶标及其抗生素耐药谱，可使临床医生在同一天内获得初步诊断信息，从而有助于制定更为恰当的治疗方案。
本文内容
摘要
摘要
血流感染常伴随高死亡率，原因在于可能发展为败血症、重度败血症和感染性休克1。因此，在血流感染的治疗中，迅速给予适当的抗生素治疗至关重要。该过程的关键在于时间，而时间又高度依赖于细菌鉴定和抗生素敏感性检测的结果。这两个参数通常通过基于培养的检测方法获得，但该方法耗时较长，平均需要24-48小时2, 4。本研究旨在开发基于DNA的检测方法，以实现对血流感染的快速鉴定以及快速的抗菌药物敏感性检测。第一种检测方法是一种基于真细菌16S rDNA的实时PCR检测，辅以种或属特异性的探针5。利用这些探针，可区分革兰氏阴性菌，包括Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa和Escherichia coli，以及革兰氏阳性菌，包括Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp.,和Streptococcus pneumoniae。通过该多探针检测方法，可在2小时内获得对致病微生物的初步鉴定结果。
其次，我们开发了一种用于抗生素药敏试验的半分子检测方法 金黄色葡萄球菌，肠球菌 spp. 及（兼性）需氧革兰氏阴性杆菌6该检测方法基于一项利用PCR技术测定细菌生长的研究。7直接从血培养中收获的细菌与多种抗生素共同孵育6小时，随后采用基于Sybr Green的实时PCR检测法测定细菌生长抑制情况。这两种方法结合可在同一天内指导选择合适的抗生素治疗方案图1综上所述，对病原体鉴定和抗生素敏感性的分子分析为病原体检出提供了更快的替代方法，并有望改善血流感染的诊断。
方案
第一部分：病原体鉴定
1. 样品制备
注意：整个分子实验流程应按照分子诊断中质量保证的相关建议进行，如以下方案所述3。
- 取0.1 ml血培养物加入到含有0.9 ml 0.9% NaCl的1.5 ml离心管中，制成1:10稀释的样品。（稀释以防止qPCR抑制）。
- 将样品在13400 × g离心5分钟，使细菌DNA形成沉淀。
- 用100 μl无菌去离子H2O重悬细菌沉淀。
- 将DNA样品储存于4 °C，待后续使用。
2. 鉴定实验：实时16S rDNA PCR
- 按如下方法配制反应混合液。每个样本需设置四个独立反应。每种混合液包含 12.50 μl 的预混液、0.9 μM 正向引物（5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3）7、0.6 μM 反向引物（5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3）8 以及一组探针。四种独立反应中探针的用量如下所示。
- 第一个反应包括：
- 0.2 μM 通用探针（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）8
- 0.2 μM P. aeruginosa 探针（5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1）
- 第二个反应包括：
- 0.2 μM E. coli 探针（5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1）
- 0.2 μM Pseudomonas spp. 探针（5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ）
- 第三个反应包括：
- 0.2 μM Staphylococcus spp. 探针（5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ）
- 0.2 μM S. aureus 探针（5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1）
- 0.2 μM Enterococcus spp. 探针（5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1）
- 第四个反应包括：
- 0.2 μM 通用探针（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）
- 0.3 μM Streptococcus spp. 探针（5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ）
- 0.2 μM S. pneumoniae 探针（5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1）
- 加入无菌去离子 H2O 至终体积为 20 μl。将每种反应混合液各 20 μl 加入 96 孔 PCR 板的孔中。
- 向每个孔中加入 5 μl 样本。
- 使用粘性封板膜密封 96 孔 PCR 板。
- 在 ABI PRISM 7900HT 实时荧光定量 PCR 系统上运行 PCR 程序，采用以下最佳热循环条件：
- 50 °C 预变性 10 分钟
- 95 °C 初始变性 15 分钟
- 42 个循环：
- 95 °C 变性 15 秒
- 60 °C 退火 1 分钟
3. 结果分析
在“分析设置”选项卡中，将Ct分析的阈值调整为0.1。将基线设置的范围调整为起始（循环数）：6，结束（循环数）：15。- 记录所有样本的循环阈值（Ct值）。可将Ct值35作为判定PCR结果为阳性的截断值。血液培养物中细菌含量范围为107至1011 CFU/ml，产生的Ct值均低于35。
第二部分：抗生素敏感性试验
4. 从阳性血培养中分离细菌9
- 从阳性血培养瓶中吸取5 ml培养液，转移至血清分离管中。
- 将血清分离管在2000 × g 条件下离心10分钟。
- 弃去血清分离管中的上清液。
- 用无菌棉签蘸取管中凝胶层的细菌，转移至0.9%氯化钠溶液中，直至获得0.5麦氏标准浊度的菌悬液。
5. 微量滴定板接种
- 将0.5麦氏浓度的菌悬液用双倍浓度的MHⅡ肉汤稀释，制备成浓度为5 × 105 CFU/mL的菌悬液。
- 将该菌悬液加入含有多种抗生素的微量滴定板孔中（表1）。
- 将微量滴定板在37 °C下孵育6小时。
- 将部分菌悬液 aliquot 置于4 °C保存（作为阴性生长对照）。
- 孵育6小时后，将每孔中的内容物以及保存在4 °C的阴性生长对照样品分别转移至无菌离心管中。
- 以16000 × g离心5分钟。
- 小心移除上清液，避免扰动细菌沉淀。
- 用无菌去离子H2O重悬沉淀。
- 用无菌去离子H2O将样品稀释10倍。
6. 实时16S rDNA PCR10
- 按下述方法配制 PCR 反应体系：
- 12.50 μl iQ SYBR Green Supermix
- 0.5 μM 正向引物 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)11
- 0.25 μM 反向引物 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3)11
- 无菌去离子 H2O 补至总体积 20 μl
- 将 20 μl PCR 反应体系加入 96 孔 PCR 板的各孔中。
- 向每孔加入 5 μl 样品。
- 使用粘性封板膜密封 96 孔 PCR 板。
- 将 PCR 板放入 MyiQ 单色实时荧光定量 PCR 检测系统中运行，采用以下优化的热循环条件：
- 初始变性：95 °C 下 4 分钟
- 初始退火：65 °C 下 30 秒
- 35 个循环，每个循环包括：
- 变性：95 °C 下 15 秒
- 退火：60 °C 下 1 分钟
- 熔解曲线分析（60–95 °C，20 分钟内以 0.57 °C 递增）
7. 结果分析
- 使用以下公式之一计算临界Ct值（根据抗生素类型选择）：
- 一般情况：
临界Ct值 = 阳性生长对照Ct值 + 0.5 × (阴性生长对照Ct值 - 阳性生长对照Ct值) - 革兰氏阴性杆菌中的哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶；金黄色葡萄球菌（S.aureus）中的阿莫西林、氯唑西林和复方新诺明；肠球菌属（Enterococcus spp.）中的阿莫西林：临界Ct值 = 阳性生长对照Ct值 + 0.25 × (阴性生长对照Ct值 - 阳性生长对照Ct值)
- 一般情况：
- 将与无菌去离子H2O共同孵育的样本作为阳性生长对照。
- 根据微生物种类，使用相应的阴性生长对照：
- 革兰氏阴性杆菌：与抗生素混合物共同孵育的样本
- Enterococcus spp.：在4 °C下保存的样本
- S.aureus：在4 °C下保存的样本
- 按以下方式判断菌株对测试抗生素的敏感性（S）或耐药性（R）：
- Ct值高于临界Ct值表示敏感
- Ct值低于临界Ct值表示耐药
8. 代表性结果
选择两种模式生物，即革兰氏阴性菌 E. coli 和革兰氏阳性菌 S. aureus，用于展示对细菌病原体进行检测、鉴定及其抗菌谱测定的联合操作流程。本方案的第一部分包括病原体鉴定。针对八种具有重要临床意义的微生物设计了特异性探针。当样本中存在细菌检测面板所涵盖的目标病原体时，将生成扩增曲线并计算Ct值（图2）。将PCR结果判为阳性的阈值设定为Ct值35。在图2A中，展示了由E. coli感染的血培养样本的鉴定图谱。16S通用探针被加入两个独立的反应体系中，因此产生两条扩增曲线（Ct值分别为25.20和25.95）。第三条信号来自针对E. coli的特异性探针（Ct值为27.04）。图2B展示了由S. aureus感染的血培养样本的鉴定结果。16S通用探针的扩增信号Ct值分别为33.35和33.71。其余两条信号分别来自针对Staphylococcus属和S. aureus的特异性探针（Ct值分别为32.48和30.59）。
在完成实验方案的第一部分后，即可确定致病微生物，并可进一步确定其抗菌谱。图3展示了一个抗生素敏感性检测的扩增曲线示例，该图所示为在图2A中也出现的大肠杆菌（E. coli）菌株。每条曲线代表细菌样本在某种抗生素存在下孵育的结果。Ct值较低的样本表明在抗生素存在下仍发生了细菌生长，提示该菌株对该抗生素具有耐药性；相反，Ct值较高的样本表明由于抗生素有效抑制了细菌生长，未发生增殖，提示该菌株对该抗生素敏感。表1展示了大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）分离株抗菌谱的判定结果。所有Ct值均已列出，并依据方案文本（7.1节）中提到的公式计算出两个Ct值截断点，用于区分耐药与敏感状态。若报告的Ct值低于计算所得的截断Ct值，则判定该菌株对该抗生素耐药；反之则判定为敏感。
图1. 利用实时16S rDNA PCR进行病原体鉴定及抗生素敏感性检测流程图。
图2. 鉴定实验：扩增曲线与循环阈值（Ct值）。 通用16S rDNA探针可检测阳性血培养，而特异性探针用于鉴定致病菌。A. 含有E. coli的血培养扩增曲线；B. 含有S. aureus的血培养扩增曲线；Pseu ae, Pseudomonas aeruginosa；uni, 16S通用探针；Ecoli, Escherichia coli探针；Pseu sp, Pseudomonas spp.探针；S. pneu, Streptococcus pneumoniae探针；Strep sp, Streptococcus spp.探针；Entero, Enterococcus spp.探针；S. aureus, Staphylococcus aureus探针；Staph sp, Staphylococcus spp.探针。
图3. 抗生素敏感性试验的扩增曲线图 E. coli 分离 （样本1）。每条曲线代表一种菌株在相应抗生素存在下孵育的结果。早期信号由高细菌载量引起，表明该菌株在测试抗生素存在下仍能生长，因此对该抗生素具有耐药性。晚期信号则表明该菌株在抗生素存在下未能生长，即对该抗生素敏感。
| 样本 1：E. coli | 样本 2：S. aureus | ||||
| AST | Ct | R/S | AST | Ct | R/S |
| 阿莫西林 8 mg/L | 16,83 | R | 阿莫西林 0.25 mg/L | 21,03 | R |
| 阿莫西林-克拉维酸 8/4 mg/L | 17,36 | R | 苯唑西林 2 mg/L | 25,80 | S |
| 哌拉西林 16 mg/L | 16,67 | R | 万古霉素 2 mg/L | 25,20 | S |
| 哌拉西林-他唑巴坦 16/4 mg/L | 24,15 | S | 庆大霉素 4 mg/L | 25,86 | S |
| 环丙沙星 1 mg/L | 29,72 | S | 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 2/38 mg/L | 24,62 | S |
| 头孢他啶 1 mg/L | 24,03 | S | |||
| 头孢他啶 8 mg/L | 26,58 | S | |||
| 庆大霉素 4 mg/L | 29,83 | S | |||
| 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 2/38 mg/L | 27,60 | S | |||
| 阴性生长对照（抗生素混合物） | 30,41 | 阴性生长对照（样品储存于 4 °C） | 27,42 | ||
| 阳性生长对照 | 16,90 | 阳性生长对照 | 20,22 | ||
| 临界 Ct 值 1* | 21,76 | 临界 Ct 值 1*** | 23,82 | ||
| 临界 Ct 值 2** | 18,75 | 临界 Ct 值 2**** | 22,02 | ||
| * 适用于阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、环丙沙星、庆大霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 ** 适用于哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶 | *** 适用于万古霉素和庆大霉素 **** 适用于阿莫西林、苯唑西林和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 |
表1. 两种样品的抗生素敏感性试验结果测定 (E.coli 和 S.aureus）。将PCR检测的Ct值复制到该Excel文件中，文件可根据方案文本中所示公式自动计算来自阳性和阴性生长对照的两个Ct值 cutoff。若某抗生素对应的Ct值低于cutoff值，则该菌株对该抗生素具有耐药性；若Ct值高于cutoff值，则该菌株对该抗生素敏感。
讨论
本文所述方案可实现对病原体的快速鉴定，并提供功能性抗菌药物谱，有助于早期给予适当的抗生素治疗，从而改善血流感染患者的预后。根据检测需求的不同条件（如低成本、高通量、最短周转时间），可对检测条件进行相应调整。整个操作流程可在一个工作日内完成。此外，该方案的两个部分可同时进行，显著缩短了检测周转时间。本文所展示的鉴定面板系根据本院临床最相关细菌种类进行筛选而得。由于该方法的核心原理是靶向16S基因区域，因此可针对其他微生物设计特异性探针并加入检测体系中。该完整检测最初旨在用于血培养样本的快速分析，但也可用于处理其他类型的样本材料。抗生素敏感性试验所使用的抗生素同样如此：可根据当地的耐药模式和临床指南，增加更多或不同的抗生素种类。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由马斯特里赫特大学医学中心重点资助基金（Profileringsfonds azM，项目编号PF245）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 水中 0.9% |
| Vacutainer SST 血清分离管 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II 肉汤 | BD Diagnostic Systems | 212322 | 水中 44 g/L |
| Centrifuge Rotixa 50 rs 离心机 | Andreas Hettich GmbH & Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D 离心机 | Eppendorf | 已停产 | |
| 引物 (Primers) | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| 探针 (Probes) | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp 光学 96 孔反应板 | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp 光学粘性封膜 | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B 粘性密封膜 | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| 实时 PCR 检测系统 | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| 实时 PCR 检测系统 | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ 单色 |
参考文献
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774(2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119(2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33(2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751(2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538(2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257(2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156(2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447(2003).
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