该方法可用于表征扩展的细菌共培养体系与EpiAirways的相互作用，后者是一种在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，具有生物学相关性 体外 模型。该方法可适用于任何能够进行长期共培养的微生物。
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摘要
摘要
不可分型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，NTHi）是一类适应人类宿主的革兰氏阴性细菌，可引起呼吸道黏膜的反复性和慢性感染1; 2。为了研究这些微生物在呼吸道组织表面及内部存活的机制，需要建立一种能够实现细菌与人类细胞长期共培养的有效模型。我们采用在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，即EpiAirway模型（MatTek，Ashland，MA）。该模型为非永生化、高度分化的三维组织，含有紧密连接、纤毛细胞和非纤毛细胞、分泌黏蛋白的杯状细胞，并保留了在感染刺激下产生细胞因子的能力。
这一具有生物学意义的 体外 人上呼吸道模型具有多种应用方式；本方法的总体目标是对EpiAirway组织与NTHi进行长期共培养，并随时间定量测定与细胞相关及被细胞内化的细菌数量。同时，还可检测感染性共培养体系中黏蛋白的产生以及细胞因子谱。该方法较现有技术更具优势，因为目前许多实验方案采用的是人源细胞的浸没式单层培养或Transwell培养系统，这些方法无法支持细菌在较长时间内的持续感染。3例如，如果病原体能够在覆盖的培养基中复制，可能导致不可接受的细胞毒性水平以及宿主细胞的丢失，从而中断实验。EpiAirway 模型可用于表征长期的宿主-病原体相互作用。此外，由于 EpiAirway 的来源为正常人支气管-气管细胞，而非永生化细胞系，因此在结构和功能上均能很好地模拟真实的人类上呼吸道组织4.
采用该方法时，EpiAirway 组织在递送前需提前 2 天逐步去除抗菌和抗真菌化合物，所有操作均在无抗生素条件下进行。由于细菌和原代人源组织在同一生物安全柜中操作，并需进行长期共培养，因此必须采取特殊的注意事项。
方案
1. 为 EpiAirway 组织准备生物安全柜
- 穿戴专用实验服，将头发扎起并戴上手套，启动层流罩。5 分钟后，将柜内所有工具（移液器、枪头、离心管等）移至一侧，用 70% 乙醇喷洒生物安全柜内部及玻璃门，再用洁净的纸巾擦拭干净。再次用 70% 乙醇喷洒已清洁的内部区域，并静置晾干。将工具移至洁净的一侧，重复乙醇消毒步骤。
- 在柜内使用带气溶胶屏障的移液枪头和专用移液器。若使用 individually-wrapped sterile serological pipettes，应将封口端穿过层流区域，打开包装，将移液管滑入柜内，并将包装丢弃在柜外。
- EpiAirway 插件必须使用无菌镊子操作。将 6 英寸细尖弯头解剖镊放入自封式灭菌袋中进行高压灭菌。准备充足数量，确保每天至少有六把可供使用。
2. 拆封 EpiAirway 组织
- 在生物安全柜内用70%乙醇喷洒工作台面，并用洁净的纸巾擦拭。再次喷洒乙醇，待表面干燥后再使用。打开EpiAirway包装盒，丢弃内部的泡沫和填充材料。
- EpiAirway无抗生素维持培养基AIR-100-MM ABF（MM）为MatTek公司专有，随插入式培养小室一同提供。在生物安全柜内，用无菌的50 ml离心管标记培养基类型和日期，并松开管盖。将培养基瓶用70%乙醇喷洒后在柜内打开，使用新的无菌刻度移液管向每根离心管中分装25 ml MM....
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讨论
该方法能够在生物相关的原代人呼吸道组织气液界面背景下，研究宿主与病原体之间的长期相互作用。本研究中采用了非典型流感嗜血杆菌（NTHi）作为感染微生物，但任何在长时间内不会引起不可接受细胞毒性的细菌与宿主的相互作用，均可通过该方法进行定量分析。EpiAirway 模型还可用于研究影响人上呼吸道的病毒、药物或化学物质5; 6; 7; 8。我们已将未感染的组织维持超过 40 天，感染 NTHi 的组织至少维持了 10 天。我们预计，如有需要，感染组织可维持更长时间。
该方法的局限性与其他任何方法类似 体外 模型存在局限性，包括无法在这些组织中重建具有正常功能的免疫系统。尽管目前通过每日冲洗组织以模拟正常的黏膜纤毛清除过程，但为这些组织产生的黏液建立一个自然的排出通道将更为理想9此外，已知NTHi的接触可诱导人呼吸道上皮细胞中黏蛋白的表达，从而加重这一问题。10另一方面，每日收集的EpiAirway灌洗液可保存并用于检测目标蛋白或酶活性，为该方法增添了重要维度，提升了其应用价值。
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致谢
我们感谢 Patrick Hayden（MatTek）提供的有益讨论，以及佐治亚健康科学大学的 Robert Smith 和 Libby Perry 在电镜技术方面的支持。本研究由美国国立耳聋与其他交流障碍疾病研究所（NIDCD）资助，项目编号 DC010187，资助对象为 D.A.D。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 皂苷 | Calbiochem | 558255-25GM | 用不含钙或镁的 D-PBS 配制成 1%，过滤除菌 |
| 1 X 含钙镁的杜尔贝科’s 磷酸盐缓冲液 | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X 不含钙镁的杜尔贝科’s 磷酸盐缓冲液 | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway 无抗生素组织 | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway 无抗生素维持培养基 | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | 随试剂盒提供 |
| 10X 磷酸盐缓冲液溶液 | EMD Millipore | 6506 | 使用前稀释至 1X |
| 明胶 | JT Baker | 2124-01 | 加入至 1 X PBS 中，终浓度为 0.1%，高压灭菌 |
| Difco GC 培养基基础（巧克力琼脂） | VWR international | 90002-016 | 将 36 g 加入 500 ml ddH2O 中高压灭菌，冷却至 60°C |
| BBL 血红蛋白（巧克力琼脂） | VWR international | 90000-662 | 将 10 g 加入 500 ml ddH2O 中高压灭菌，冷却至 60°C，然后与上述 GC 培养基基础混合 |
| BD BBL IsoVitaleX 增菌剂（巧克力琼脂） | VWR international | 90000-414 | 将 GC 培养基基础与血红蛋白的混合物冷却至 55°C，加入 10 ml 重悬的 IsoVitaleX，倾注巧克力琼脂平板 |
| 解剖镊，细尖，弯型 | VWR international | 82027-406 | |
| 自封式灭菌袋 | VWR international | 89140-802 | |
| 硫酸庆大霉素，10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | 每毫升 EpiAirway MM 中加入 10 微升用于庆大霉素杀灭实验 |
参考文献
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I.
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