使用的EpiAirway模型，用于描述长期宿主 - 病原体相互作用

摘要

此方法允许EpiAirways，初级人类呼吸道上皮组织生长在气 - 液界面，生物有关延长细菌共同培养的表征在体外车型。该方法可用于任何微生物，是经得起长期的合作文化。

摘要

Nontypeable 流感嗜血杆菌 （NTHI）是人类适应革兰氏阴性菌，可引起复发和慢性感染的呼吸道粘膜^{1 2。}要研究的机制，这些生物生存和呼吸组织内，一个是必需的，可以进行长期成功的细菌和人类细胞的共培养模式。我们使用初级人类呼吸道上皮组织，提高气 - 液界面，EpiAirway模型（MatTek，阿什兰，马萨诸塞州）。这些都是非永生化，分化良好，3维的组织，包含紧密连接，纤毛和nonciliated细胞，杯状细胞产生的粘蛋白，并保留产生细胞因子对感染的反应能力。

有关这种生物在人类上呼吸道的体外模型可以用在许多方面;这种方法的总体目标是，随着时间的推移执行长期NTHI和定量EpiAirway组织共培养细胞相关的和内在的细菌。同时，受感染的共同文化的生产和粘蛋白，细胞因子的个人资料才能确定。这种方法提高了，许多当前的协议后，现有的方法，利用人体细胞淹没单层或Transwell小文化，这是不能够支持长时间^的细菌感染超过3。例如，如果一个有机体，可以在覆媒体复制，这可能导致在宿主细胞的细胞毒性和损失不可接受的水平，逮捕了实验。 EpiAirway模型允许长期宿主 - 病原体相互作用的特性。此外，由于EpiAirway源是人体正常细胞，而不是一个永生行气管支气管，每一个实际人类上呼吸道组织的优秀代表，在^结构和功能4 ，。

对于这种方法，EpiAirway组织断奶2天交货前的抗微生物和抗真菌化合物，和所有的程序都无抗生素的条件下进行。这就需要特殊的考虑，因为这两种细菌和小学的人体组织在同一生物安全柜使用，并长时间共同培养。

方案

1。为EpiAirway组织准备生物安全柜

1. 穿着专用的白大褂，头发绑背和手套，开始层流。 5分钟后，将在内阁（移液器，小技巧，离心管等），任何一方的工具，喷洒生物安全柜内部和窗框用70％乙醇，并用干净的纸巾擦拭。用70％乙醇再次喷洒清洁的室内，并留下来干。干净的一侧移动工具和重复乙醇的过程​​。
2. 在内阁中的气溶胶屏障枪头和专用的移液器。要使用单独包装的无菌血清移液器，通过层流插入年底，破开，滑入机柜的吸管，丢弃的包装外面。
3. EpiAirway插入必须用无菌镊子处理。放置6英寸的细尖弧形分割成自我封闭消毒袋和高压灭菌镊子。准备足够的至少有6个每天准备使用。

2。开箱EpiAirway组织

1. 喷雾用70％乙醇在生物安全柜的工作表面，并用干净的纸巾擦拭。喷一遍，让表面干燥，使用前。打开EpiAirway盒和丢弃的发泡胶及包装材料。
2. EpiAirway不含抗生素的维护媒体，AIR - 100 - MM的亚洲债券基金（MM），是专有的MatTek在插入套件发送。在生物安全柜，媒体类型和日期的标签六个无菌的50 mL离心管，并松开帽。喷雾用70％乙醇的媒体的瓶子，并打开机柜内的。分装成每管每使用一个新的血清无菌吸管管25毫升的MM，收紧的上限，并储存在4 ° C使用新鲜的MM等分的每一天。
3. 重复上述新鲜瓶使用1 ×贝科的磷酸盐缓冲液（D - PBS）与钙和镁的2.2。再次重复使用的D - PBS无钙和镁的。所有分装保存在4 ° C。
4. EpiAirway插入空气- 100到达在24孔板中，在4 ° C的固体培养基含有琼脂糖中，必须放置到6孔板使用。标签的日期和使用乙醇耐标记的描述，每块板。将1毫升到每口井的4℃EpiAirway的MM。删除其包装，喷以70％的乙醇和生物安全柜中进行，运输板块。取出磁带和开放的板块。使用高压灭菌镊子，取出EpiAirway插入潮湿的纱布。
5. 拿起与使用，扭转运动，以帮助释放琼脂糖蒸压钳插入，并将其放置到6孔板以及。一些琼脂糖可能会坚持到插入的，特别是运输板的温度升高到环境。使用无菌棉签小心地取出插入琼脂糖。避免接触的膜，并检查，无气泡下方插入被困。放入5％的CO ₂饱和湿度37℃培养箱中培养板。
6. 允许至少24小时的组织，以平衡前开始联合培养的孵化器。

3。 EpiAirway组织维修

1. 使用高压灭菌镊子，拿起一个插入，轻轻吸液管200微升预热的D - PBS到组织中的钙和镁的岩石插入。倾斜角度的插入和对持有膜插入底部的塑料环，无菌P1000的枪头。请勿触摸的组织。吸的D - PBS漂洗，并放入一个标记的无菌离心管。样品可以冷冻在-20 ° C，并在稍后的日期为粘蛋白和/或细胞因子的表达的测定。
2. 更改基础MM每天吸和替换用1毫升的新鲜MM。每口井使用一个新的障碍枪头。治疗用10％漂白粉的使用媒体过夜，并丢弃。

4。接种EpiAirway组织

1. nontypeable 流感嗜血杆菌 （NTHI）从冰冻甘油的新鲜培养了数到巧克力琼脂。成长在加湿5％ _二氧化碳培养箱中培养过夜。
2. 第二天，在预热的D - PBS重悬与钙和镁的OD（600 nm）的约0.7 NTHI单菌落。涡大力前的光密度测量。光密度的关系，集落形成单位每毫升（CFU / ml的）的NTHI，外径为0.2（600纳米）约等于1.0 × ¹⁰ 8 CFU /毫升。因此，外径为0.7（600 nm）的约3.5 × 10 ⁸ CFU / ml的。每个NTHI应变，以接种前，应验证该算法。
3. EpiAirway组织AIR - 100是生长在插入了0.6厘米和0.4微米膜的表面积。组织是由〜8.0 × 10 ^5〜1.0 × 10 ^{6 <}/ SUP>细胞。因此，接种1.0 × 10 ⁷ CFU对应的多重感染了大约10 - 12。接种，冲洗每3.1 EpiAirway插入，然后加入28微升4.2准备在生物安全柜中的每个EpiAirway插入根尖表面的细菌悬液。不要接种基底MM。返回每块板的孵化器。

5。量化NTHI接种

1. 0.1％的明胶（PBS - G），高压灭菌消毒，准备一个磷酸盐缓冲液（PBS）的解决方案。标签无菌的1.5 ml Eppendorf管所需1:10稀释成每管接种和分装900微升无菌PBS - G OD（600 nm）的基础。
2. 确定枚举接种NTHI巧克力琼脂板的数量。这些板块上下颠倒放置在空气孵化器与上半盘一小时休息的底部。这将使板块既温暖至37 ° C，表面干燥，促进NTHI下降电镀。
3. 开始串行1:10稀释的菌悬液加入100微升4.2管头的接种。涡每个稀释大力前5秒，使未来。下降到预热和表面干燥的巧克力琼脂平板10微升等份，每个稀释度板的一半的使用。可容纳五至六个10微升等分之一，每100毫米的钢板的一半，而无需运行起来。当干燥，倒挂在加湿37 ° C的CO ₂培养箱中过夜。
4. 第二天，确定CFU / ml的计数稀释，每下降15-30独特的殖民地和计算您的实际可行的NTHI接种。

6。长期合作的文化与NTHI

1. 每隔24小时，洗净的插入，然后在3.1池已接种一脉相承的细菌和冻结在-20 ° C在一个标记的离心管，供日后分析每个组织的洗涤。这些样本可检测粘蛋白斑点杂交或用ELISA细胞因子的表达。此外，组织可以为mRNA的收获，并可以就感兴趣的基因进行定量PCR。更改基底MM每天在3.2。继续进行共培养时间。

7。收获EpiAirway组织

1. 准备一个新鲜的1％皂素的解决方案，在没有钙和镁的D - PBS，过滤消毒和温暖至37 ° C。
2. 没有钙和镁的温暖的MM和另一个D - PBS管50毫升至37 ° C。
3. 准备在5.1稀释管，以及一个空的无菌的1.5 ml Eppendorf管中，每插入，与插入的数目和NTHI应变标记。
4. 可收获的EpiAirways任总细胞相关的细菌，其中包括壁和内化的生物体，或只有内在的细菌。
5. 巧克力琼脂平板上确定的数量，需要下拉板细胞相关或入侵NTHI，标签和一小时，在空气干燥的孵化器为5.2。
6. 收获总细胞相关的细菌，200微升的D - PBS无钙或镁的EpiAirways根尖表面冲洗三次，然后插入倾斜和任何剩余的MM从基底膜冲洗。先洗可以冻结，为以后的分析;丢弃以下的清洗。
7. 从7.1到每个组织的根尖表面，放置在一个新的6孔没有MM平板洗插入，和吸液管250微升无菌的1％皂素的解决方案。孵化器10分钟。
8. 从孵化器中取出，并使用无菌P1000的枪头，磨砂膜的组织，使用一回的往复运动，圆周运动，删除插入的边缘组织。使用大口径的无菌P1000的枪头，放入7.3编写的空标记管悬挂。插入到根尖表面无钙或镁中加入250微升的D - PBS。
9. 检查插入一个倒置相差显微镜，以确定是否有任何剩余的组织收割。如果需要的话，再次与P1000的另一个无菌枪头擦洗，然后添加7.8管悬挂使用大口径的无菌P1000的枪头。管1毫升使用的D - PBS无钙或镁的总量。
10. 大力旋涡细胞悬液，在一分钟的最高时速。使用无菌装上了26号针头的1 ml注射器，通过针头注射器吸进暂停。慢慢穿过针3次暂停，注意不要创建气泡。涡大力为一分钟再次。
11. 进入第7编写的稀释管大口径枪头，100微升的暂停使用。3。涡大力五秒钟，然后使串行1:10稀释。落板的上表面干燥的巧克力琼脂平板所需的稀释。
12. 收获内在的细菌，洗3次，用200微升的D - PBS无钙或镁每个插入。保留和冻结先洗。硫酸庆大霉素的终浓度为100微克/ ml预热的MM。准备1.5毫升收割每次插入媒体。替换与含有庆大霉素的MM基础毫米，300微升含有庆大霉素的MM添加到根尖表面。将板回一小时到的CO ₂培养箱。
13. 删除从根尖表面含有庆大霉素的MM和洗根尖表面和基底膜广泛预热的D - PBS无钙和镁的插入。继续在7.7-7.11。

8。代表性的成果:

扫描电子显微镜（A）的未受感染的EpiAirway组织和（二）组织的为期5天的文化合作与NTHI后如图1所示。，不造成重大损害的心尖的长期文化合作与NTHI组织，强调了实用的EpiAirway模型。描绘以上的时间内组织量化的内在细菌的数量是一个图 ，如图2所示，结果是相当重现，EpiAirway 组织一致和生物体外培养的人体上呼吸道模型相关研究NTHI宿主-病原体相互作用。

图1。EpiAirway组织扫描电子显微镜。 A.未感染控制组织。 B.组织后，共培养5天，与NTHI。在受感染的组织观察根尖表面无重大损害。

图2 NTHI内在随着时间的推移，在EpiAirway合作文化。 R2866菌株接种在约1.0 × 10 ⁷ CFU /插入（0天），然后在每一个指定的时间点的内在细菌收获。条代表N = 3至少在重复复制。误差棒的SD。

讨论

这种方法允许的长期宿主 - 病原体相互作用的首要人权组织在气 - 液界面的呼吸生物学相关背景调查。在这里，我们使用了感染的有机体NTHI，但用这种方法可以量化的任何细菌的相互作用，不引入不可接受的细胞毒作用随着时间的推移。 EpiAirway模式也可以被用于研究病毒，药物或化学物质，影响人类的上呼吸道^{5 6 7 8。}我们一直保持着超过40天，与NTHI感染的组织至少10天未感染的组织。我们预计，如果需要的话，受感染的组织可以显着延长维持。

这种方法的局限性是类似于任何体外模型，其中包括一个主管在这些组织中的免疫系统无法重建。虽然组织的日常清洗，以模仿正常的粘液纤毛清除功能，建立在这些组织生产的粘蛋白的一个自然的出口^将更为可取9。此外，接触NTHI被称为诱导人呼吸道上皮细胞的粘蛋白的表达，加剧了^问题 10 。另一方面，每天EpiAirway洗可以保存和检测的蛋白质或酶的利益活动，增加了一个重要的维度的方法，并增加其实用性。

在这种方法的成功性能的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录＃	评论
皂素	Calbiochem	558255 - 25GM	在D - PBS无钙或镁的1％，过滤消毒
1 + X贝科的磷酸盐缓冲生理盐水与钙和镁	龙沙	17 - 513Q
1 + X贝科的磷酸盐缓冲生理盐水无钙或镁	龙沙	17 - 515Q
EpiAirway抗生素自由组织	MatTek	AIR - 100 - ABF
EpiAirway抗生素免费维修媒体	MatTek	AIR - 100 - MM - ABF	提供试剂盒
10X磷酸盐缓冲盐溶液	电解二氧化锰	6506	使用前稀释成1X
明胶	JT贝克	2124-01	在1 × PBS和高压灭菌，加入终浓度为0.1％
DIFCO GC中等基地（巧克力琼脂）	VWR	90002-016	高压灭菌36克在500毫升DDH 2 O和冷却到60 ° C
BBL血红蛋白（巧克力琼脂）	VWR	90000-662	高压灭菌10克，500毫升DDH 2 O，冷却至60 ° C和混合与GC以上中型基地
BD BBL IsoVitaleX浓缩（巧克力琼脂）	VWR	90000-414	GC中型基地和血红蛋白的混合物冷却至55℃，添加10毫升水合IsoVitaleX，倒入巧克力琼脂平板
解剖钳，尖端细，弯曲	VWR	82027-406
自密封的消毒袋	VWR	89140-802
硫酸庆大霉素，10毫克/毫升	龙沙	17 - 519Z	加入10微升/毫升EpiAirway的MM庆大霉素杀死