该方法可用于表征扩展的细菌共培养体系与EpiAirways的相互作用，后者是一种在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，具有生物学相关性 体外 模型。该方法可适用于任何能够进行长期共培养的微生物。
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摘要
摘要
不可分型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，NTHi）是一类适应人类宿主的革兰氏阴性细菌，可引起呼吸道黏膜的反复性和慢性感染1; 2。为了研究这些微生物在呼吸道组织表面及内部存活的机制，需要建立一种能够实现细菌与人类细胞长期共培养的有效模型。我们采用在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，即EpiAirway模型（MatTek，Ashland，MA）。该模型为非永生化、高度分化的三维组织，含有紧密连接、纤毛细胞和非纤毛细胞、分泌黏蛋白的杯状细胞，并保留了在感染刺激下产生细胞因子的能力。
这一具有生物学意义的 体外 人上呼吸道模型具有多种应用方式；本方法的总体目标是对EpiAirway组织与NTHi进行长期共培养，并随时间定量测定与细胞相关及被细胞内化的细菌数量。同时，还可检测感染性共培养体系中黏蛋白的产生以及细胞因子谱。该方法较现有技术更具优势，因为目前许多实验方案采用的是人源细胞的浸没式单层培养或Transwell培养系统，这些方法无法支持细菌在较长时间内的持续感染。3例如，如果病原体能够在覆盖的培养基中复制，可能导致不可接受的细胞毒性水平以及宿主细胞的丢失，从而中断实验。EpiAirway 模型可用于表征长期的宿主-病原体相互作用。此外，由于 EpiAirway 的来源为正常人支气管-气管细胞，而非永生化细胞系，因此在结构和功能上均能很好地模拟真实的人类上呼吸道组织4.
采用该方法时，EpiAirway 组织在递送前需提前 2 天逐步去除抗菌和抗真菌化合物，所有操作均在无抗生素条件下进行。由于细菌和原代人源组织在同一生物安全柜中操作，并需进行长期共培养，因此必须采取特殊的注意事项。
方案
1. 为 EpiAirway 组织准备生物安全柜
- 穿戴专用实验服，将头发扎起并戴上手套，启动层流罩。5 分钟后，将柜内所有工具（移液器、枪头、离心管等）移至一侧，用 70% 乙醇喷洒生物安全柜内部及玻璃门，再用洁净的纸巾擦拭干净。再次用 70% 乙醇喷洒已清洁的内部区域，并静置晾干。将工具移至洁净的一侧，重复乙醇消毒步骤。
- 在柜内使用带气溶胶屏障的移液枪头和专用移液器。若使用 individually-wrapped sterile serological pipettes，应将封口端穿过层流区域，打开包装，将移液管滑入柜内，并将包装丢弃在柜外。
- EpiAirway 插件必须使用无菌镊子操作。将 6 英寸细尖弯头解剖镊放入自封式灭菌袋中进行高压灭菌。准备充足数量，确保每天至少有六把可供使用。
2. 拆封 EpiAirway 组织
- 在生物安全柜内用70%乙醇喷洒工作台面，并用洁净的纸巾擦拭。再次喷洒乙醇，待表面干燥后再使用。打开EpiAirway包装盒，丢弃内部的泡沫和填充材料。
- EpiAirway无抗生素维持培养基AIR-100-MM ABF（MM）为MatTek公司专有，随插入式培养小室一同提供。在生物安全柜内，用无菌的50 ml离心管标记培养基类型和日期，并松开管盖。将培养基瓶用70%乙醇喷洒后在柜内打开，使用新的无菌刻度移液管向每根离心管中分装25 ml MM，拧紧管盖后于4°C保存。每天使用新鲜分装的MM。
- 使用一瓶新的含钙和镁的1×Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）重复步骤2.2。再使用不含钙和镁的D-PBS重复一次。所有分装液均储存于4°C。
- EpiAirway插入式培养小室AIR-100以24孔板形式在4°C下随含琼脂糖的固体培养基运输，使用前需转移至6孔板中。使用耐乙醇标记笔在每块板上标注日期和描述。向每个孔中加入1毫升4°C的EpiAirway MM。将运输板从包装中取出，喷洒70%乙醇后放入生物安全柜。撕去封口膜并打开培养板。使用已灭菌的镊子移除覆盖在EpiAirway插入式培养小室上的湿润纱布。
- 用已灭菌的镊子夹住插入式培养小室，通过旋转动作帮助其从琼脂糖中脱离，并将其放入6孔板的孔中。部分琼脂糖可能粘附在小室上，尤其当运输板温度升至室温时。使用无菌棉签小心去除插入式培养小室上的琼脂糖。避免接触膜表面，并检查确认插入式培养小室下方无气泡 trapped。将6孔板放入含5% CO2的湿润化37°C培养箱中。
- 在开始共培养前，至少让组织在培养箱中平衡24小时。
3. EpiAirway 组织的维持
- 使用已灭菌的镊子夹取一个插入式培养小室，在其组织上轻轻加入 200 微升预热的含钙镁 D-PBS，并轻轻晃动小室。将小室倾斜一定角度，将无菌的 P1000 移液枪头紧贴插入式小室底部固定膜的塑料环处，注意不要接触组织。吸取 D-PBS 洗液并转移至已标记的无菌冻存管中。样品可在 -20°C 冷冻保存，后续用于黏蛋白和/或细胞因子表达的检测。
- 每天更换基础培养基，通过吸除并替换为 1 毫升新鲜的 MM。每个孔均需使用新的屏障移液枪头。使用后的培养基需加入 10% 次氯酸钠溶液过夜处理后再行丢弃。
4. EpiAirway 组织的接种
- 从冻存的甘油菌种中挑取非分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi）新鲜菌种，划线接种于巧克力琼脂平板上，在加湿的含5% CO2的培养箱中过夜培养。
- 次日，将NTHi单菌落重悬于预热的含钙和镁的D-PBS中，调整菌液在600 nm处的光密度（OD）至约0.7。测量光密度前需剧烈涡旋混匀。NTHi的光密度与每毫升菌落形成单位（CFU/ml）之间的换算关系为：OD（600 nm）0.2约等于1.0 × 108 CFU/ml。因此，OD（600 nm）0.7约相当于3.5 × 108 CFU/ml。在接种前，应针对每种NTHi菌株验证该换算关系的准确性。
- EpiAirway组织AIR-100生长于插入式培养小室中，其表面积为0.6 cm2，膜孔径为0.4微米，每块组织含有约8.0 × 105至1.0 × 106个细胞。因此，接种1.0 × 107 CFU的细菌相当于感染复数（MOI）约为10–12。接种时，在生物安全柜中按步骤3.1冲洗每个EpiAirway插入小室，然后向其顶端表面加入28微升按步骤4.2制备的细菌悬液。切勿接种基底侧的培养基（MM）。接种完成后将培养板放回培养箱继续培养。
5. NTHi 接种物的定量
- 配制含0.1%明胶的磷酸盐缓冲液（PBS-G），经高压灭菌后备用。根据接种物的OD（600 nm）值，标记若干无菌的1.5 ml离心管用于进行1:10系列稀释，并向每管中分装900微升无菌PBS-G。
- 确定用于计数接种的NTHi所需的巧克力琼脂平板数量。将这些平板倒置放入恒温培养箱中，使平板底部搁在盖子的一半之上，放置1小时。此操作可使平板温度升至37°C，同时表面干燥，有利于NTHi的滴加接种。
- 开始对接种物进行1:10系列稀释：取4.2步骤中的细菌悬液100微升加入第一管中。每次稀释前，需将前一管剧烈涡旋振荡5秒。将10微升的等分试样滴加到预热并表面干燥的巧克力琼脂平板上，每个稀释度使用平板的一半区域。每个100 mm平板的一半区域可容纳5至6个10微升液滴，且不会相互融合。待液滴干燥后，将平板倒置放入37°C、含CO2的湿润培养箱中过夜培养。
- 次日，选择每个液滴中含有15–30个独立菌落的稀释度进行菌落计数，并据此推算出实际的NTHi活菌接种浓度（CFU/ml）。
6. 与NTHi的长期共培养
- 每隔24小时，按照3.1步骤清洗插入式培养小室，然后将接种同一种细菌菌株的每种组织的洗液合并，并分装至已标记的冻存管中，于-20°C保存，以备后续分析。这些样本可通过点印迹法检测黏蛋白的存在，或通过ELISA检测细胞因子的表达水平。 Alternatively，也可收集组织用于提取mRNA，并对目标基因进行qPCR分析。按照3.2步骤每日更换基础培养基MM。共培养期间持续执行上述操作。
7. EpiAirway 组织的收获
- 配制新鲜的1%皂苷溶液（溶于不含钙和镁的D-PBS中），经滤膜除菌后升温至37°C。
- 将50 ml MM培养基和另一份不含钙和镁的D-PBS分别预热至37°C。
- 按步骤5.1准备稀释管，同时为每个插入物准备一个无菌的1.5 ml离心管，并标记插入物编号及NTHi菌株。
- EpiAirways组织可用于收获总细胞相关细菌（包括黏附和内化细菌），或仅收获内化细菌。
- 确定用于滴板法接种细胞相关或侵入性NTHi所需的巧克力琼脂平板数量，标记后在空气培养箱中干燥1小时，操作同5.2。
- 为收获总细胞相关细菌，用200 µL不含钙和镁的D-PBS冲洗EpiAirways顶面三次，然后倾斜插入物，冲洗基底膜上残留的MM培养基。第一次冲洗液可冻存以备后续分析；弃去后续冲洗液。
- 将清洗后的插入物放入不含MM的新鲜6孔板中，用移液器将250 µL步骤7.1制备的无菌1%皂苷溶液加入每个组织的顶面，放回培养箱孵育10分钟。
- 从培养箱取出后，使用无菌P1000移液枪头以前后移动的方式刮取组织，再以环形运动刮除插入物边缘的组织。使用大孔径无菌P1000移液枪头将悬液转移至步骤7.3中准备的标记离心管中。再向插入物顶面加入250 µL不含钙和镁的D-PBS。
- 使用倒置相差显微镜检查插入物，判断是否有残留组织需进一步收获。如有需要，使用另一支无菌P1000移液枪头再次刮取，并用大孔径无菌P1000移液枪头将悬液加入步骤7.8中的离心管。最后用不含钙和镁的D-PBS将管内总体积补至1 ml。
- 将细胞悬液在最大转速下剧烈涡旋震荡1分钟。使用装有26号针头的无菌1 ml注射器，通过针头将悬液吸入注射器，缓慢推注通过针头3次，注意避免产生气泡。再次剧烈涡旋震荡1分钟。
- 使用大孔径移液枪头，取100 µL悬液加入步骤7.3中准备的第一个稀释管中，剧烈涡旋震荡5秒，随后进行1:10系列稀释。将所需稀释度的样品滴加至表面干燥的巧克力琼脂平板上。
- 若仅收获内化细菌，用200 µL不含钙和镁的D-PBS对每个插入物冲洗三次。保留并冻存第一次冲洗液。将庆大霉素硫酸盐加入预热的MM培养基中，终浓度为100 µg/ml。按每插入物1.5 ml准备含药培养基。更换插入物底部的MM为含庆大霉素的培养基，并在顶面加入300 µL含庆大霉素的MM。将培养板放回CO2培养箱孵育1小时。
- 移除顶面含庆大霉素的MM，并用预热的不含钙和镁的D-PBS对插入物的顶面和基底膜进行充分冲洗。随后按步骤7.7–7.11操作。
8. 代表性结果：
扫描电子显微照片显示（A.未感染的 EpiAirway 组织和（B.与NTHi共培养5天后的组织如图所示 图1. 长期与NTHi共培养不会对上皮组织造成显著损伤，凸显了EpiAirway模型的实用性。下图显示了随时间推移组织内化细菌数量的定量结果。 图2. 两种结果均具有良好的可重复性，表明EpiAirway组织具有一致性和生物学相关性 体外 用于研究NTHi宿主-病原体相互作用的人类上呼吸道模型
图1. EpiAirway 组织的扫描电子显微镜图像。A. 未感染的对照组织。B. 与NTHi共培养五天后的组织。在感染组织中，顶端表面未观察到明显损伤。
图 2. EpiAirway 共培养过程中随时间被内化的 NTHi 数量。菌株 R2866 在第 0 天接种，浓度约为 1.0 × 107 CFU/insert，随后在各指定时间点收获以检测内化细菌数量。柱状图表示至少重复两次的三重重复实验（n=3）。误差线表示标准差（SD）。
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讨论
该方法能够在生物相关的原代人呼吸道组织气液界面背景下，研究宿主与病原体之间的长期相互作用。本研究中采用了非典型流感嗜血杆菌（NTHi）作为感染微生物，但任何在长时间内不会引起不可接受细胞毒性的细菌与宿主的相互作用，均可通过该方法进行定量分析。EpiAirway 模型还可用于研究影响人上呼吸道的病毒、药物或化学物质5; 6; 7; 8。我们已将未感染的组织维持超过 40 天，感染 NTHi 的组织至少维持了 10 天。我们预计，如有需要，感染组织可维持更长时间。
该方法的局限性与其他任何方法类似 体外 模型存在局限性，包括无法在这些组织中重建具有正常功能的免疫系统。尽管目前通过每日冲洗组织以模拟正常的黏膜纤毛清除过程，但为这些组织产生的黏液建立一个自然的排出通道将更为理想9此外，已知NTHi的接触可诱导人呼吸道上皮细胞中黏蛋白的表达，从而加重这一问题。10另一方面，每日收集的EpiAirway灌洗液可保存并用于检测目标蛋白或酶活性，为该方法增添了重要维度，提升了其应用价值。
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致谢
我们感谢 Patrick Hayden（MatTek）提供的有益讨论，以及佐治亚健康科学大学的 Robert Smith 和 Libby Perry 在电镜技术方面的支持。本研究由美国国立耳聋与其他交流障碍疾病研究所（NIDCD）资助，项目编号 DC010187，资助对象为 D.A.D。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 皂苷 | Calbiochem | 558255-25GM | 用不含钙或镁的 D-PBS 配制成 1%，过滤除菌 |
| 1 X 含钙镁的杜尔贝科’s 磷酸盐缓冲液 | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X 不含钙镁的杜尔贝科’s 磷酸盐缓冲液 | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway 无抗生素组织 | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway 无抗生素维持培养基 | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | 随试剂盒提供 |
| 10X 磷酸盐缓冲液溶液 | EMD Millipore | 6506 | 使用前稀释至 1X |
| 明胶 | JT Baker | 2124-01 | 加入至 1 X PBS 中，终浓度为 0.1%，高压灭菌 |
| Difco GC 培养基基础（巧克力琼脂） | VWR international | 90002-016 | 将 36 g 加入 500 ml ddH2O 中高压灭菌，冷却至 60°C |
| BBL 血红蛋白（巧克力琼脂） | VWR international | 90000-662 | 将 10 g 加入 500 ml ddH2O 中高压灭菌，冷却至 60°C，然后与上述 GC 培养基基础混合 |
| BD BBL IsoVitaleX 增菌剂（巧克力琼脂） | VWR international | 90000-414 | 将 GC 培养基基础与血红蛋白的混合物冷却至 55°C，加入 10 ml 重悬的 IsoVitaleX，倾注巧克力琼脂平板 |
| 解剖镊，细尖，弯型 | VWR international | 82027-406 | |
| 自封式灭菌袋 | VWR international | 89140-802 | |
| 硫酸庆大霉素，10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | 每毫升 EpiAirway MM 中加入 10 微升用于庆大霉素杀灭实验 |
参考文献
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