使用细胞色素线粒体呼吸功能的可视化 C氧化酶/琥珀酸脱氢酶（COX / SDH），双标组织化学

Summary

（COX / SDH），细胞色素C氧化酶/钠脱氢酶双标记方法允许直接可视化的新鲜冷冻组织切片中线粒体呼吸酶的缺陷。这是一个简单的组织化学技术，并在调查线粒体疾病，老化和衰老有关的疾病非常有用。

Abstract

线粒体DNA（mtDNA）的缺陷是疾病的重要原因，可能背后的老龄化和老龄化有关的改建^1,2。衰老的线粒体理论表明mtDNA突变的作用，它可以改变生物能动态平衡和细胞的功能，在衰老过程^中 3 。财富已编译的证据支持这一理论的^1,4，例如线粒体DNA的mutator鼠标^5;然而，线粒体老化损坏的确切作用是不完全了解^6,7。

观察呼吸酶的活性，是一个简单的方法进行调查线粒体功能障碍。复杂的四，或细胞色素 c氧化酶（COX），是对线粒体功能至关重要。环氧合酶的催化亚基由线粒体DNA编码和复杂的装配（图1）是必不可少的。因此，适当的合成和功能主要是基于对线粒体DNA的^完整性 2 。虽然可以调查其他呼吸道疾病复合物，复合物IV和II是最适合组织化学^检查 8,9 。复杂的二，或琥珀酸脱氢酶（SDH），完全是由核DNA（图1）编码，其活动通常不会受损线粒体的影响，虽然增加可能表明线粒体^生物合成10-12。观察受损的线粒体DNA在线粒体疾病，老化，与年龄有关的疾病往往导致低或缺乏COX活性^2,12-14细胞的存在。虽然COX和SDH活动可以单独进行调查^，15,16连续的双标记方法已被证明是在寻找与细胞线粒体功能^障碍 12,17-21有利。

许多检测的最佳宪法已经确定，如底物浓度，电子受体/捐助者，中间电子载体，pH值的影响，反应吨IME ^9,22,23。 3,3' -二氨基联苯胺（DAB）是一种有效和可靠的电子供^体 22 。在运作的COX细胞，棕色indamine聚合物产品本地化线粒体嵴和饱和细胞^22。因此，这些细胞功能失调的COX将不饱和民建联产品，硝基四氮唑（NBT），电子受体的减少SDH活性的可视化，一个蓝色^的甲臜最终产品9,24。添加到细胞色素 C和琥珀酸钠基板内源性水平之间的控制和患病/突变体的^组织 9正常化。过氧化氢 ​​酶增加一条，作为一项预防措施，以避免可能的污染从过氧化物酶的^活性 9,22反应。 methosulfate吩嗪（PMS），中间电子载体，是叠氮化钠，呼吸链抑制剂，结合使用，以增加形成的最终反应^产物 9,25 。尽管这一通知ATION，影响这个看似简单的检测结果的一些关键细节，除了特异性的控制和在技术的进步，都尚未提出。

Protocol

1。组织编制为cryosectioning

1. 按照与现有的伦理许可证牺牲的动物，无论是颈椎脱位或斩首。
2. 快速收集利益的组织（如大脑），并迅速冻结干冰（组织可能需要用液态氮冷冻，以获得最佳的形态在戊烷或丙烷冻结）。铝箔存储于-80℃直至组织准备节。
3. cryosectioning冰冻组织嵌入在准备。
4. 收集14微米的低温恒温器部分在-21 ° C（可能需要调整温度± 1-2 ° C）。解冻部分上使用coverslipping直到准备使用在-20 ° C加热块，并将其存储幻灯片的幻灯片。

2。环氧合酶组织化学

1. 让幻灯片在室温下干燥1小时。将幻灯片在幻灯片用湿滤纸染色室，切成条状。为了获得consisten在每个实验吨结果，建议处理最多10％实验幻灯片，以尽量减少时间延误。
2. 准备下化学罩1X民建联，100微米0.1 M的PBS pH值= 7.0细胞色素C。涡迅速。
3. 新增2微克牛过氧化氢 ​​酶^（2微克^毫升 -1或-1毫升约4 IU）。震荡向上突破所有的过氧化氢酶颗粒混合。
4. 应用150 - 200μL孵化中期到每个幻灯片，使用枪头，均匀地分布到所有路段。
5. 40分钟的幻灯片在37 ° C。
6. 从幻灯片中删除多余的解决....

Discussion

合并COX / SDH组织化学方法使细胞线粒体功能障碍的可视化。这种技术，与早期的研究可追溯到到1968年，仍然深受市民欢迎，许多考虑它的"金标准"，确定线粒体疾病患者^{14,19,26,27。}现在常用的调查mtDNA突变驱动的老化和衰老相关的^疾病 12,13,18,20,21,24 。 COX / SDH双标记方法经常被用来与其他技术的同时，确定具体的mtDNA突变，并进一步调查，如oximetric测量^和分光光度酶分析28,29 ，线粒体呼吸酶。

在其长期使用，但重要的细节，简单的特异性控制，和进步，改善方法都尚未提出。在组织的处理方面，重要的是要使用新鲜冰冻组织与本techniqUE，因为虽然考克斯将生存福尔马林固定，SDH不会。虽然这是一个技术的限制，已发现没有验尸报告延迟干涉用这种^方法 24，但建议迅速取出感兴趣的器官保存形态。然而，连续冻融循环的组织和部分应尽量避免。干冰，可能会被冻结的组织样本，但是，一些组织可能需要在戊烷或用液氮冷却，以获得最佳的形态，并避免冻结文物丙烷冻结。也应确.......

Materials

试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
干冰	AGA气体AB	块形式
戊烷（2 - 甲基）	Sigma - Aldrich公司	277258 CAS:78-78-4
Cyrostat嵌入解决方案	樱花Finetek	组织TEK 4583
低温恒温器	MICROM	MICROM型号HM 500M
幻灯片	Thermo Scientific的	超级冰霜加 门泽尔格拉泽 J1800AMWZ
盖玻片 硼硅玻璃	VWR International的	16004-098	24 × 50 mm的
滤纸	Munktell过滤器AB	质量:1350 文章编号:242 001	430 × 430毫米
3,3' - 二氨基tetrahydrochloride（DAB）	Sigma - Aldrich公司	西格玛液体基底系统，D7304
细胞色素 C（III型，从马的心脏）	Sigma - Aldrich公司	C2506 CAS:9007-43-6
牛过氧化氢酶（肝脏）	Sigma - Aldrich公司	C9322 CAS:9001-05-2
硝基四氮唑（NBT）	Sigma - Aldrich公司	N6876 CAS:298-83-9
琥珀酸钠	Sigma - Aldrich公司	S2378 CAS:6106-21-4
methosulfate吩嗪（PMS）	Sigma - Aldrich公司	P9625 CAS:299-11-6	PMS是光敏感。免受光线照射。
叠氮化钠	Sigma - Aldrich公司	S8032 CAS:26628-22-8
二甲苯	VWR International的	EM - XX0060 - 4
Entellan	VWR International的	100503-870
丙二 （丙二酸）	Sigma - Aldrich公司	M1296 CAS:141-82-2