一种用于胚胎小鼠血管标记的方法

摘要

本文介绍了一种标记胚胎皮肤和胸腺血管的方法。

摘要

功能性血管网络的建立是器官发生过程中必不可少的部分，也是实现器官最佳功能所必需的。例如，在胸腺中，正常血管的形成与模式构建对于胸腺细胞进入器官以及成熟T细胞向外周输出至关重要。胸腺内血管的空间分布依赖于局部微环境的信号，特别是胸腺上皮细胞（TEC）所提供的信号。近年来多项研究表明，这些信号的破坏会导致胸腺血管结构的缺陷^1,2。以往的研究已描述了用于标记新生期和成年期胸腺血管系统的技术^1,2。本文展示了一种用于标记胚胎期胸腺血管的方法。该方法结合使用FITC-葡聚糖或Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia凝集素I（GSL 1 - 异凝集素B₄）经面静脉注射，并联合CD31抗体染色以识别胸腺血管结构，同时使用PDGFR-β标记胸腺周围血管间充质^3-5。本方案还提供了使用冷冻切片或振动切片的选择。该实验流程可用于识别胸腺血管缺陷，这对于明确胸腺上皮细胞来源分子在胸腺血管形成中的作用至关重要。由于该方法可标记整个血管系统，因此也可用于分析胚胎中多个器官和组织的血管网络，包括皮肤和心脏^6-10。

方案

1. 采用荧光素标记的葡聚糖和GSL I-异凝集素B₄经面静脉注射标记胚胎血管系统

1. 在1.5 mL离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制50 µg/mL的FITC-葡聚糖溶液，或用PBS配制20 µg/200 µL的GSL 1 - 异凝集素B₄溶液，并将溶液预热至37°C。向FITC-葡聚糖溶液中加入100 µL浓度为1.25 mM的Fast Green/PBS储备液（总体积1 mL），向GSL 1 - 异凝集素B₄溶液中加入180 µL相同浓度的Fast Green/PBS储备液（总体积200 µL），使溶液呈现明显的蓝色。
2. 解剖E14.5至E18.5天的胚胎及其卵黄囊，保留尿囊柄（脐动脉和脐静脉）完整。
3. 将胚胎转移至新的培养皿（60 × 15 mm）中，并在室温下浸入PBS中。
4. 调整胚胎位置，使其头部/面部呈矢状面视图。使用显微解剖镊子轻轻夹住胚胎头部以固定。
5. 使用30G针头，将50 µL的FITC-葡聚糖溶液（50 µg/mL）或200 µL PBS中的GSL 1 - 异凝集素B₄溶液（含20 µg）注入面部静脉，针头方向朝向头后部。
6. 当染料在脐静脉中可见时，移出针头，并将胚胎与尿囊柄（脐动脉和脐静脉）分离。
7. 注射完成后，将胚胎在室温PBS中静置2–3分钟，使染料在胚胎全身循环。

2. 皮肤血管系统的整体染色分析

1. 待染料在胚胎内充分循环后，从肢芽、背部、腹部等区域取皮肤样品^8,9。
2. 用冷PBS清洗皮肤样品，并在4%多聚甲醛（PFA）/PBS中固定2小时^8,9。将样品置于含2 mL冷PBS的4 mL透明小瓶中，清洗3次，每次10分钟。
3. 将皮肤样品置于载玻片上，每张载玻片加入100 μL封片介质，并加盖盖玻片。
4. 将载玻片置于避光的储存区域中干燥。
5. 进入第2步“图像采集”部分。

3. 用于冷冻切片的胸腺和心脏血管及血管周围细胞的多色标记（接第1节第7步）

1. 将整个胚胎在液氮中进行“闪冻”。胚胎可于 -80°C 保存至分析前。
2. 或者，取出胸腺组织，用 4°C 的 PBS 冲洗，然后在 2 mL 4% 多聚甲醛（PFA）/PBS 中固定 2 小时。用冷 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟，将胸腺置于 OCT 包埋剂中，冷冻后于 -80°C 保存备用。
3. 进行冷冻切片时，将 OCT 包埋剂涂布于切片“模具”上，并将胚胎或已分离的器官/组织固定于其中以进行切片。
4. 将冷冻组织切成 10 μm 厚的切片，并收集到载玻片上。
5. 用丙酮固定切片 5–10 分钟。用冷 TBS 洗涤 3 次。
6. 在室温下的湿盒中，用 10% 驴血清/TBS 进行封闭。
7. 在湿盒中，4°C 条件下孵育切片 1 小时至过夜，加入 100 μl 一抗：本示例中使用大鼠抗小鼠 CD31 抗体（1:100）标记内皮细胞，以及山羊抗小鼠 PDGFR-β 抗体（1:100）标记血管周细胞。建议使用剪裁好的 Parafilm 封口膜覆盖载玻片，以确保抗体在切片上均匀分布。
8. 一抗孵育结束后，用冷 TBS 洗涤切片 3 次。随后加入 100 μl 合适的二抗，孵育至少 30 分钟。
9. 用冷 TBS 洗涤 3 次。每张载玻片上加入 100 μl 封片介质，并加盖盖玻片。
10. 将载玻片置于避光环境中干燥保存。
11. 进入“图像采集”部分。

4. 用于振动切片的胸腺血管及血管周围细胞多色标记（接第1节第7步）

1. 从胚胎中解剖出胸腺叶，并用冷 PBS 冲洗。
2. 在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）/PBS 固定胸腺 2 小时。
3. 用 PBS-Triton X（0.15%）洗涤 3 次，每次 10 分钟；将胸腺放入小型塑料包埋盒中，浸入 4% 低熔点琼脂糖/PBS 溶液（约 4°C）。胸腺应紧贴包埋盒底部。
4. 将包埋盒置于冰上使琼脂糖凝固（3–5 分钟）。用剃刀切去多余琼脂糖。在振片机样品块上涂抹胶水，将样品牢固粘附于其上。
5. 向振片机水浴中加入冷 PBS，直至样品和刀片完全浸没。
6. 设置振片机的振动幅度和速度（高振幅、低至中等速度适用于较软的胸腺组织切片）。若因振动过强导致切片破碎，应适当降低振幅。
7. 切取 50 μm 厚的切片。
8. 使用画笔将切片收集至 24 孔细胞培养板中，置于冷 PBS 内。
9. 用含 10% 驴血清的 PBS-Triton X（0.15%）溶液在 24 孔板中封闭切片，每孔 500 μL，封闭 30 分钟。
10. 在加盖的 24 孔板中，加入一抗（如抗 CD31 和抗 PDGFR-β 抗体），4°C 孵育 8 小时至过夜。
11. 在 4°C 条件下，用 PBS-Triton X（0.15%）洗涤 3 次，总时长 8 小时。
12. 用含 10% 驴血清的 PBS-Triton X（0.15%）溶液封闭切片 30 分钟。
13. 加入合适的二抗，在 4°C 孵育 8 小时至过夜。
14. 在 4°C 条件下，用 PBS-Triton X（0.15%）洗涤 3 次，总时长 8 小时。
15. 将样品置于冰上，用 4% PFA/PBS 重新固定 30 分钟。
16. 在冰上用 PBS-Triton X（0.15%）洗涤 3 次，共 30 分钟。
17. 通过梯度甲醇/PBS-Triton X 溶液对样品进行脱水处理：依次为 25% 甲醇、50% 甲醇、75% 甲醇和 100% 甲醇，每步 10 分钟。10 分钟后更换一次 100% 甲醇，继续在室温下孵育 1 小时。
18. 在玻璃容器中按 1:2 比例配制 BABB 溶液（苯甲醇:苯甲酸苄酯）。将 BABB 与甲醇混合，终浓度为 50% BABB 和 50% 甲醇。将样品在 BABB:甲醇混合液中孵育 10–15 分钟。
19. 将样品转移至盛有 100% BABB 的玻璃容器中，在室温下孵育 10–15 分钟，或直至组织完全透明。
20. 取凹面载玻片（深度 0.7 mm），加入新鲜的 100% BABB，将样品转移至其中。盖上盖玻片（No. 1.5），用 2–3 层指甲油密封边缘。置于暗处室温下静置，待指甲油完全硬化后，将样品存于 4°C。
    注意： 共聚焦显微镜成像前，玻片必须完全密封。图像应在 12–24 小时内采集，因荧光染料在 BABB 中会逐渐褪色。
21. 进入“图像采集”部分继续操作。

5. 图像采集

1. 使用 Plan-Apochromat 20X/0.8 物镜（512 × 512 像素），结合 488 nm（FITC-葡聚糖/GSL 1 - 异凝集素 B₄）、543 nm 和 633 nm 激光线，通过共聚焦显微镜对 10 μm 冷冻切片进行成像。
2. 使用 Plan-Apochromat 10X/0.4 物镜（512 × 512 像素），结合 488 nm（FITC-葡聚糖/GSL 1 - 异凝集素 B₄）、543 nm 和 633 nm 激光线，采集全层皮肤铺片和 50 μm 琼脂糖包埋切片的共聚焦 z 轴序列图像。每个通道应以 1 微米间隔连续采集连续 z 轴切片。
3. 使用 Zeiss Axiovision 4.6 或其他图像分析软件重建连续 z 轴切片图像。

6. 代表性结果：

对胚胎血管系统进行高效标记对于评估胚胎小鼠中血管缺陷至关重要。图1显示了E16.5胸腺血管的特异性标记（1A-B），以及与CD31的共标记（1B），此外还展示了左右心室的染色结果（1E-F）。这些实验采用了第1、3和5节所述的GSL I-凝集素B₄冰冻切片标记方案。使用第1、2和5节所述方案对E16.5小鼠皮肤血管网络进行整体标记的结果如图1C-D所示。

图 1 图注。向 E16.5 小鼠胚胎面部静脉注射 FITC 标记的 GSL I - 异凝集素 B₄。a. 注射后胚胎胸腺的冷冻切片。 b. 异凝集素 B₄ 与 CD31 共标记的叠加图像。 c. 和 d. 注射后胚胎皮肤血管系统的整体封片观察。 e. 和 f. 注射后胚胎心脏的冷冻切片，e.（右心室）f.（左心室）。

讨论

整体染色及PECAM-1（CD31）切片染色是标记小鼠胚胎血管系统的常规方法。这些方法需要使用直接和/或间接免疫荧光技术，并使用去垢剂以通透小鼠组织。这一过程往往耗时较长。本文中，我们采用FITC-葡聚糖或异凝集素B₄经面静脉注射，直接标记胚胎血管系统，从而省去了抗体标记步骤。此外，该方法还可用于评估血管系统的功能状态，因为“渗漏性”表型可通过本方法显现，而常规抗体染色法则无法检测到此类表型。

我们通过分析胚胎胸腺和心脏切片以及面部静脉注射后不久的皮肤血管整体装片，验证了该技术的效率。此外，我们在注射FITC-葡聚糖或凝集素B₄后对胸腺切片进行CD31染色，以证明FITC可特异性地标记胚胎血管结构。因此，胚胎面部静脉注射FITC-葡聚糖或凝集素B₄可用于快速评估发育过程中多个器官的血管表型。此外，该方法使研究人员能够确定胚胎外周血管通过血管发生与特定器官建立连接的具体发育时间点。我们还提供了一种与FITC-葡聚糖或凝集素B₄染色兼容的抗体标记方案。利用该方案，可使用PDGFR-β、SMA-α及其...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖	Sigma-Aldrich	FD150S-1G
荧光素标记 GSL 1 - 异凝集素 B4	Vector Laboratories	FL-1201
快绿	MP Biomedicals	195178
多聚甲醛	Fluka	76240
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
最佳切割温度包埋剂（O.C.T.）	VWR international	25608-930
丙酮	JT Baker	9006-33
驴血清	Jackson	017-000-121
大鼠抗小鼠 CD31	BD Biosciences	558736
山羊抗小鼠 PDGFR-β	R&D Systems	AF1042
驴抗大鼠 CD31 Alexa 647（Invitrogen）	Biolegend	102516
驴抗山羊 Alexa 594（Invitrogen）	Invitrogen	A11058
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	X-100
低熔点琼脂糖/PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
甲醇	Fisher Scientific	A413-4
苯甲醇	Acros Organics	148390010
苯甲酸苄酯	Acros Organics	105860010
凹面载玻片	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel 封片剂	Electron Microscopy Sciences	17985-10
盖玻片（22×22）-1.5	Thermo Fisher Scientific, Inc.	152222
蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.
显微解剖镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Parafilm 密封膜 OM992	Fisher Scientific	13-374-16
12 孔和 24 孔细胞培养板	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Superfrost/Plus 显微载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
4 mL 透明小瓶	National Scientific Company	B7800-2