方法文章

一种用于胚胎小鼠血管标记的方法

DOI：

10.3791/3267

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2011年10月7日

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1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

本文内容

摘要

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本文介绍了一种标记胚胎皮肤和胸腺血管的方法。

摘要

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功能性血管网络的建立是器官发生过程中必不可少的部分，也是实现器官最佳功能所必需的。例如，在胸腺中，正常血管的形成与模式构建对于胸腺细胞进入器官以及成熟T细胞向外周输出至关重要。胸腺内血管的空间分布依赖于局部微环境的信号，特别是胸腺上皮细胞（TEC）所提供的信号。近年来多项研究表明，这些信号的破坏会导致胸腺血管结构的缺陷1,2。以往的研究已描述了用于标记新生期和成年期胸腺血管系统的技术1,2。本文展示了一种用于标记胚胎期胸腺血管的方法。该方法结合使用FITC-葡聚糖或Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia凝集素I（GSL 1 - 异凝集素B4）经面静脉注射，并联合CD31抗体染色以识别胸腺血管结构，同时使用PDGFR-β标记胸腺周围血管间充质3-5。本方案还提供了使用冷冻切片或振动切片的选择。该实验流程可用于识别胸腺血管缺陷，这对于明确胸腺上皮细胞来源分子在胸腺血管形成中的作用至关重要。由于该方法可标记整个血管系统，因此也可用于分析胚胎中多个器官和组织的血管网络，包括皮肤和心脏6-10。

方案

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1. 采用荧光素标记的葡聚糖和GSL I-异凝集素B4经面静脉注射标记胚胎血管系统

  1. 在1.5 mL离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制50 µg/mL的FITC-葡聚糖溶液，或用PBS配制20 µg/200 µL的GSL 1 - 异凝集素B4溶液，并将溶液预热至37°C。向FITC-葡聚糖溶液中加入100 µL浓度为1.25 mM的Fast Green/PBS储备液（总体积1 mL），向GSL 1 - 异凝集素B4溶液中加入180 µL相同浓度的Fast Green/PBS储备液（总体积200 µL），使溶液呈现明显的蓝色。
  2. 解剖E14.5至E18.5天的胚胎及其卵黄囊，保留尿囊柄（脐动脉和脐静脉）完整。
  3. 将胚胎转移至新的培养皿（60 × 15 mm）中，并在室温下浸入PBS中。
  4. 调整胚胎位置，使其头部/面部呈矢状面视图。使用显微解剖镊子轻轻夹住胚胎头部以固定。
  5. 使用30G针头，将50 µL的FITC-葡聚糖溶液（50 µg/mL）或200 µL PBS中的GSL 1 - 异凝集素B4溶液（含20 µg）注入面部静脉，针头方向朝向头后部。
  6. 当染料在脐静脉中可见时，移出针头，并将胚胎与尿囊柄（脐动脉和脐静脉）分离。
  7. 注射完成后，将胚胎在室温PBS中静置2–3分钟，使染料在胚胎全身循环。

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讨论

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整体染色及PECAM-1（CD31）切片染色是标记小鼠胚胎血管系统的常规方法。这些方法需要使用直接和/或间接免疫荧光技术，并使用去垢剂以通透小鼠组织。这一过程往往耗时较长。本文中，我们采用FITC-葡聚糖或异凝集素B4经面静脉注射，直接标记胚胎血管系统，从而省去了抗体标记步骤。此外，该方法还可用于评估血管系统的功能状态，因为“渗漏性”表型可通过本方法显现，而常规抗体染色法则无法检测到此类表型。

我们通过分析胚胎胸腺和心脏切片以及面部静脉注射后不久的皮肤血管整体装片，验证了该技术的效率。此外，我们在注射FITC-葡聚糖或凝集素B4后对胸腺切片进行CD31染色，以证明FITC可特异性地标记胚胎血管结构。因此，胚胎面部静脉注射FITC-葡聚糖或凝集素B4可用于快速评估发育过程中多个器官的血管表型。此外，该方法使研究人员能够确定胚胎外周血管通过血管发生与特定器官建立连接的具体发育时间点。我们还提供了一种与FITC-葡聚糖或凝集素B4染色兼容的抗体标记方案。利用该方案，可使用PDGFR-β、SMA-α及其.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本工作获得美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）授予 NRM 的资助编号 R01AI055001 和 R01AI082127，以及授予 JLB 的 SREB 博士论文奖学金资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖Sigma-AldrichFD150S-1G
荧光素标记 GSL 1 - 异凝集素 B4Vector LaboratoriesFL-1201
快绿MP Biomedicals195178
多聚甲醛Fluka76240
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11550
最佳切割温度包埋剂（O.C.T.）VWR international25608-930
丙酮JT Baker9006-33
驴血清Jackson017-000-121
大鼠抗小鼠 CD31BD Biosciences558736
山羊抗小鼠 PDGFR-βR&D SystemsAF1042
驴抗大鼠 CD31 Alexa 647（Invitrogen）Biolegend102516
驴抗山羊 Alexa 594（Invitrogen）InvitrogenA11058
吐温 X-100Sigma-AldrichX-100
低熔点琼脂糖/PBSSigma-AldrichA9414-25G
甲醇Fisher ScientificA413-4
苯甲醇Acros Organics148390010
苯甲酸苄酯Acros Organics105860010
凹面载玻片Fisher ScientificS175201
Fluorogel 封片剂Electron Microscopy Sciences17985-10
盖玻片（22×22）-1.5Thermo Fisher Scientific, Inc.152222
蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜Carl Zeiss, Inc.
显微解剖镊Roboz Surgical Instruments Co.RS-5135
Parafilm 密封膜 OM992Fisher Scientific13-374-16
12 孔和 24 孔细胞培养板Evergreen Scientific222-8044-01F
Superfrost/Plus 显微载玻片Fisher Scientific12-550-15
4 mL 透明小瓶National Scientific CompanyB7800-2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....

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标签

FITC GSL 1 B4 CD31 PDGFR

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