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使用硅探针在麻醉大鼠中记录大规模神经元集群活动

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DOI：

10.3791/3282

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2011年10月19日

 , 
1Canadian Centre for Behavioural Neuroscience, University of Lethbridge

本文内容

摘要

将介绍在麻醉大鼠中使用硅探针进行神经元活动的细胞外记录技术。该技术能够同时从超过100个神经元中获取多个脑区的信息，以单细胞分辨率提供关于多个局部神经回路中神经元集群动态的信息。

摘要

大规模神经元群体的电生理记录为研究大脑如何通过神经元的放电活动协调多种多样的行为提供了机会。同时监测多个局部神经回路中大量神经元放电活动的最有效方法之一是使用硅电极阵列1-3。

动作电位在细胞体附近产生显著的跨膜电压变化。这些输出信号可通过将导体放置在神经元附近进行测量。如果在电极尖端附近存在多个活跃（放电）的神经元，电极将记录到所有这些神经元的复合信号，其中单个神经元的贡献由其“电学距离”决定。由于具有大量记录位点（+64）和小体积，硅探针是监测多个神经元的理想记录电极。此外，多个记录位点可沿毫米级距离分布，从而实现对不同皮层层或多个皮层柱中神经元活动的同时记录（图1）。重要的是，记录位点在几何结构上的精确定位还可用于确定分离出的单个神经元之间的空间关系4。本文中，我们描述了在麻醉大鼠中，使用硅探针同时对左右前肢体感皮层进行急性、大规模神经元记录的方法（图2）。

方案

1. 手术准备

  1. 使用适当类型和剂量的麻醉剂对大鼠进行麻醉。本实验采用乌拉坦（1.5 g/kg，Sigma-Aldrich Co.，St. Luis, MO），将其20 g溶于100 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中配制成20%溶液，即动物腹腔注射（IP）给予7.5 ml/kg的乌拉坦溶液。由于乌拉坦的剂量-反应曲线特性，总剂量分为四次给药，每次间隔约30分钟。在前两次注射乌拉坦之前，先使用异氟烷（浓度3-4%，氧气流速2升/分钟）对动物进行麻醉，并在之后维持于2%浓度（氧气流速最高2升/分钟），以防止动物因注射而产生应激反应。在手术过程中，如需要，可额外给予异氟烷（2%浓度，持续2分钟）。
  2. 剃除切口部位（头部背侧）的毛发，以确保毛发不会污染伤口，并保证切口周围有足够的区域可进行消毒处理。
  3. 使用有机碘或氯己定皂液及消毒剂（乙醇）对手术区域进行无菌准备。
  4. 准备硅探针（NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI）。探针可用70%乙醇消毒，随后用蒸馏水冲洗。如需要，可在探针上涂抹无菌配制的荧光标记物（例如Dye I, Invitrogen Co.），以便后续通过组织学分析确定探针位置。操作时使用细小且极柔软的画笔，轻轻接触硅探针背面进行染色。此操作必须在显微镜下进行，以确保探针不被损坏或弯曲。务必检查确认染料未堵塞任何通道。探针上残留的染料可在后期用酒精清除，再用清水冲洗。
  5. 硅电极使用注意事项：由于尺寸微小，硅探针非常脆弱，即使操作谨慎也极易断裂。因此，建议始终注意潜在风险，包括：(i) 将探针存放于专用的保护盒中；(ii) 操作时避免碰撞或掉落探针；(iii) 确保立体定位仪操纵器固定牢固，防止意外发生；(iv) 记录过程中，周围组织和/或血液可能附着在探针上，因此记录结束后取出探针时也需格外小心。强烈建议使用持续的PBS或生理盐水冲洗；(v) 每次记录后必须清洁探针。清洁时强烈推荐将探针浸入液体酶清洁剂（Boston, Bausch & Lomb）中数分钟，随后用蒸馏水彻底冲洗，并放回专用储存盒中。根据我们的经验，妥善维护的硅探针可保证超过10次实验的良好记录质量。若使用过程中某一通道出现噪声，应在后续分析中排除该通道。我们发现通道间的串扰极小，因此单个噪声通道通常对其他通道信号影响甚微。

2. 手术

  1. 手术操作前，在眼表涂抹眼膏。
  2. 皮下注射地塞米松 5 mg/ml 以减轻脑部炎症。
  3. 在整个手术过程中，将动物固定在立体定位仪中。
  4. 在切口前，于切口部位皮下注射盐酸利多卡因2%含肾上腺素（2-4 mg/kg，稀释至0.5%溶液），以减少伤口出血风险并实现局部麻醉。
  5. 沿头皮正中线做一个2 cm的切口，并将皮肤向两侧剥离以暴露颅骨表面。
  6. 通过钝性分离清除头皮背侧的筋膜，并使用显微电凝或骨蜡控制出血。
  7. 在颅骨枕骨上钻两个孔，用于安装小螺丝，作为动物接地和参考电极。参考电极螺丝必须与硬脑膜接触。为减少记录过程中的电噪声，建议始终使螺丝保持湿润。为此，可在螺丝周围制作一个小的丙烯酸屏障，或用琼脂覆盖螺丝。
  8. 在对应于目标皮层和/或皮层下区域的坐标处，制作一个直径为1-2 mm的颅骨开孔 5根据需要在开颅（钻孔）过程中使用压缩空气清除骨屑。通过滴加 PBS 防止钻孔导致颅骨过热。如有需要，可进行第二次开颅以插入第二根探针。本视频中展示了同时记录两个皮层区域的信号，因此进行了两次开颅。
  9. 在两个颅骨开窗周围用丙烯酸树脂（例如：Lang Dental Manufacturing, Co., Inc., Wheeting, IL）构建一个小屏障，以保持磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖暴露的硬脑膜，防止其干燥。在整个实验过程中持续灌注 PBS。
  10. 打开两个颅骨切口处的硬脑膜。可使用两根针头（30½号）在尖端弯曲成钩状，用于此操作。
  11. 将硅探针的连接器固定到立体定位操纵器上。连接器应固定在一根立柱上，以确保探针的探臂与立体定位操纵器完全平行。这对于维持稳定的记录并避免探针损坏至关重要。
  12. 将参考螺丝连接到硅探针的参考引脚。为降低电噪声，接地螺丝必须连接至：i）探针插头的接地端；ii）记录设备的机箱接地端；iii）立体定位仪框架。
  13. 将硅探针的尖端轻轻接触软脑膜。
  14. 缓慢插入硅探针，并确保硅探针的探针臂（图 1 & 2）可无阻力或弯曲地插入脑组织。
  15. 小心地降低探针，直至到达目标记录区域。如有需要，可在颅骨开孔处滴加 PBS 液滴，以防止组织干燥。
  16. 由于乌拉坦麻醉仅适用于终末性操作，动物应通过腹腔注射至少200 mg/kg的戊巴比妥钠（稀释浓度不超过60 mg/ml）实施安乐死，随后进行断头处理。

3. 代表性结果：

局部场电位和放电活动的代表性记录如图3A所示。在进行峰电位分选（区分来自不同神经元的峰电位；图3B,C；6, 7, 8）后，硅探针记录能够用于研究参与以下多种过程的神经元群体活动：记忆与决策9、可塑性10、刺激编码11、自发性活动12以及多种药物的作用13。

使用硅探针的神经记录装置；示意图显示神经通路、探针设计及放置位置。
图1. A. 单叉臂硅探针示例叠加在重建神经元的拼合图像上（承蒙S. Sakata提供14）。B. 每个8个叉臂均具有四电极构型的探针示例。C. 大鼠颅骨示意图。绿色方框表示右侧和左侧体感皮层开颅范围。

神经科学实验；小鼠脑部手术，电极监测神经元活动，实验装置。
图 2. 将硅探针插入前额叶皮层和海马体的实验示例。颅骨开窗处覆盖有 PBS 液滴，以防止暴露的脑组织干燥。位于小脑上方的两颗螺丝将分别连接至接地端和参考电极。

多通道瞬态吸收光谱分析；显示能量相关性和时间演化的图谱。
图3. A. 图像显示了一个四电极记录的代表性局部场电位（LFP）500毫秒的电生理记录（注：纵坐标向上表示负电压）。插图显示了一个动作电位的波形。B. 来自一个四电极在特征空间中神经元簇的二维视图。每个簇代表来自单个神经元单元（神经元）的动作电位。C. 来自单个四电极四个记录位点的代表性神经元单元（以颜色编码）的平均动作电位波形。D. 记录到的动作电位随时间变化的波形能量（与幅度相关）。注意每个单元的能量值相对恒定；这表明在显示时间段内记录稳定。

讨论

本文演示了如何使用硅电极阵列同时记录多个皮层区域中的大量神经元（>100）的活动。为了确保手术和记录的成功，应考虑以下问题：

  1. 探针插入目标区域：将探针插入脑组织时，可能会造成显著的组织损伤，从而导致记录到的神经元信号质量下降。为避免此问题，我们建议采取以下措施：（i）以一定角度插入探针（推荐使用10度角），这样可减少被记录神经元树突的损伤；（ii）探针进入脑组织后，初始阶段可较快地下降（约每10–30秒下降50至100微米），直至接近目标记录区域。当探针距离目标区域约200微米时，应减慢调整速度（约每2至3分钟下降10微米）。
  2. 记录信号的稳定：当探针到达指定区域并检测到较明显的神经活动（多数通道出现清晰的尖峰信号）时，建议在开始正式记录前等待约30分钟。这有助于脑组织在探针插入后实现机械性稳定，从而获得更稳定的记录信号。
  3. 脑组织搏动：有时可观察到脑组织搏动，这会显著降低记录质量。通过制作一个较小的颅骨开窗（仅足够容纳探针）可减少记录区域的脑搏动。如有必要，可穿刺小脑延髓池，以降低脑脊液压力，减轻脑组织肿胀和搏动。
  4. 硅探针构型：硅探针具有多种形状和记录位点排布方式。例如，其在探针臂数量、臂的长度与厚度，以及记录位点的排列方式（如四极构型与线性构型）上可能存在差异（参见：www.neuronexustech.com）。具体实验中探针构型的选择取决于所要解决的科学问题。例如，若目标是记录某一特定皮层内多个位置的神经元群体活动（如本记录所示），最佳选择是使用具有八个探针臂且为四极构型的探针。这种构型可在每个四极位点记录多个单细胞信号，并在1.4毫米范围内实现八个位置的采样。另一种情况，若研究目标是探究神经活动在皮层各层之间的传播，则应选择具有单个探针臂且记录位点沿臂均匀分布的探针，以便同时记录多个皮层层次的活动14。

致谢

本工作由 NSERC 和 AHFMR 资助。作者感谢 Mariam Alaverdashvili 和 Amanda Mauthe-Kaddoura 对手稿提出的修改意见，以及 Hiroe Yamazaki 在手术准备方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乌拉坦Sigma-Aldrich
磷酸盐缓冲液（PBS）
异氟烷Benson Medical Instruments02241315
硅探针 NeuroNexus Technologies4 X 2 - Tet - 5 mm - 150 - 200 – 312
染料 I（DiIC18(3))Invitrogen617830
地塞米松 5Vé辅酶Q10氢醌形式0A0640B
眼膏Vé辅酶Q10氢醌形式005165414
盐酸利多卡因 2% 加肾上腺素 Bimeda-MTC00141984
立体定位仪Kopf Instruments1430-B
电极操作器与固定器Kopf Instruments960
大鼠耳杆Kopf Instruments1955
大鼠适配器Kopf Instruments920
麻醉面罩Kopf Instruments906
手术刀Roboz外科器械公司RS-9843
手术刀片帕拉贡0086
显微解剖剪 Roboz外科器械公司RS-5910
螺钉高德·帕斯滕斯有限公司14084701
止血钳Roboz外科器械公司RS-7130 RS-7211
30½ 规格针头BD 生物科学305115
微马达控制ForedomHP4-917
解剖镊Roboz外科器械公司RS-5237
骨蜡LukensM263500
压缩空气瓶Falcon BD50-10521C
酶清洁剂 博士伦BAUSCH497628
蒸馏水
牙科丙烯酸粉末朗氏牙科1220
牙科丙烯酸液体朗氏牙科1404
Digital Lynx SX 系统Neuralynx Inc.4SX-Z400
Cheeta 软件Neuralynx 公司
鳄鱼夹电缆

参考文献

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  2. Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
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