我们展示了如何对加拿大国家研究委员会制造的平面膜片钳芯片进行灭菌、预处理、加入培养基、接种细胞，并用于电生理记录。
本文内容
摘要
摘要
由于其极高的灵敏度以及能够在离子通道水平上监测和控制单个细胞，膜片钳技术已成为应用于疾病模型和药物筛选的电生理学金标准1。该方法传统上是通过将一支充满生理溶液的玻璃微电极轻柔地接触细胞，以隔离其尖端下方的一小片细胞膜2。插入微电极中的记录电极可捕获该膜片中的离子通道活动，或在膜片破裂后记录整个细胞的电活动。在过去十年中，已提出以膜片钳芯片作为替代方案3,4：一层悬空薄膜将生理介质与培养基分隔开，薄膜上经微加工形成的微孔则取代了微电极的尖端。膜片钳芯片已被集成到自动化系统中，并实现了商业化，用于高通量筛选5。为提高通量，这些芯片包含从悬浮液中流体输送细胞、通过负压将细胞定位在微孔上方，以及自动检测细胞与探针之间形成密封并进入全细胞模式的程序。我们曾报道过一种硅基膜片钳芯片的制备方法，其优化了阻抗和孔道形状，可在培养的蜗牛神经元中高质量地记录动作电位6；最近，我们也报道了在检测哺乳动物神经元方面的进展7。我们的膜片钳芯片在加拿大光子学制造中心8（一家商业代工厂）制备，可批量提供。我们热切希望与电生理学家开展合作，以验证NRCC技术在不同模型中的应用。芯片的使用遵循图1所示的一般方案：硅芯片位于聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）培养瓶底部，微孔背面连接一条地下通道，通道两端装有导管。细胞在瓶内培养，位于探针上方的细胞则通过插入通道中的测量电极进行监测。两个外侧的流体接口可在几乎不干扰细胞的情况下实现溶液更换；相较于用于细胞内灌流的玻璃微电极，这是其一大优势。
图1. 使用NRCC膜片钳芯片的测量原理
本文详细介绍了芯片的灭菌与灌流、培养基装载、细胞接种，以及最终用于电生理记录的实验方案。
方案
1. 芯片制备
文献6所述方法可制备出厚度为3 μm的自支撑薄膜，具有1 MΩ的低接入电阻，以及表面光滑、呈漏斗状的孔道，有利于与细胞形成紧密密封9，见图2。芯片经单片化后，被粘接至聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）封装体内，使孔道朝向一个连接芯片与地下通道的孔洞。粘接方式的设计可将分流电容最小化至标称值17 pF。封装体配备两根直径1.5 mm、长6 mm的玻璃管作为流体通道接口（图3）。
图 2. 国家研究理事会（NRCC）膜片钳芯片的聚焦离子束截面扫描电子显微图像，显示了光滑的二氧化硅表面和有利于细胞紧密接触的漏斗形状，以及较浅的孔口结构，后者导致较低的接入电阻。
图 3. 一块芯片被粘接在培养小瓶底部，置于一个配有地下流体系统和玻璃管的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）封装装置中。
2. 灭菌、引液和测试
以下步骤应在生物安全柜中进行，以避免孔径污染或堵塞。
- 使用 Harrick 基本等离子清洗机（www.harrickplasma.com），在 0.1–0.3 mbar 的残余空气压力下，以最大功率 18 W 处理芯片 15 分钟进行灭菌。也可使用其他空气等离子系统，但需保持相近的功率密度（24 mW/cm3），并维持功率密度与时间的乘积恒定。等离子处理还可使芯片表面亲水化，有利于后续灌注。
- 将玻璃管与无菌的 Silastic 实验室硅胶管（内径 1 mm × 外径 2 mm，Cole Parmer 目录号 # 96115-08）连接，一端留出 3 英寸，另一端留出 1 英寸。
- 通过硅胶管用无菌过滤的标准磷酸盐缓冲液（PBS）灌注流体通道，确保无气泡残留。
- 从短端以 1 atm 压力加压 PBS 时，夹住长端硅胶管。在样品瓶中可能观察到 PBS 从孔隙中渗出。夹闭加压的 PBS 供应端，并将短端硅胶管从供液端拆下。
- 使用注射器向样品瓶中加入过滤后的 PBS。
- 将 Ag/Ag:Cl 电极浸入短端硅胶管中，将对电极浸入样品瓶中。使用阻抗计确认通路电阻在 300 kΩ 至 3 MΩ 之间，旁路电容在 10 pF 至 25 pF 之间。电阻过低的芯片可能存在泄漏，电容过高的芯片则被认为不适合使用，因其可能无法捕捉细胞电生理的最快动态6。电容过低或电阻过高的芯片被视为堵塞，但也可能是孔隙中困有气泡所致。部分芯片在 1 小时后重新测试，可发现其电化学阻抗恢复正常。
- 用无菌去离子水冲洗流体通道；倒空上方样品瓶，并用同种液体冲洗两次。
- 将带管路的封装芯片浸入新鲜无菌去离子水中 30 分钟，随后与其他芯片一同置于盛有无菌去离子水的无菌容器中保存。此举可确保芯片保持亲水性，并防止污染。
3. 细胞生物学实验室中的芯片制备
以下步骤需在高效空气过滤（HEPA）的层流罩内采用无菌技术进行，本实验所使用的所有溶液必须在使用前通过0.22μm滤器过滤灭菌。
- 在HEPA过滤的层流罩下打开芯片容器，并将芯片从容器中倒置取出，以避免将可能漂浮的污染物带入顶部小瓶中。
- 用新鲜过滤的无菌去离子水冲洗芯片顶部小瓶2次，以去除芯片表面任何残留的碎屑。
- 吸除顶部小瓶中的无菌去离子水。
- 将连接至流体通道的一端硅胶管连接到装有无菌过滤去离子水的加压注射器上。在我们的系统中，装有溶液的注射器通过连接至设定为20 psi的压缩空气罐进行加压。为确保无菌，空气在进入注射器前经过0.22 μm滤器过滤，且系统配备有开关阀，可根据需要停止或施加压力。
- 使用止血钳夹紧管路的输出端。
- 打开开关阀以对溶液加压。
- 为用新鲜无菌去离子水冲洗芯片的地下流体通道，松开管路输出端的夹子。
- 为迫使水流经孔口向上流动，使用止血钳夹紧管路的输出端。
- 为防止水排出，使用止血钳夹紧管路的输入端和输出端，并关闭开关阀。
- 将管路的输入端从注射器上拆下。
- 将玻璃塞插入管路两端，并移除止血钳。
- 用过滤除菌的去离子水填充顶部小瓶。
- 将一个35 mm无菌培养皿的盖子放入100 mm无菌培养皿的底部。
- 将芯片放置在35 mm培养皿盖子上方，并用100 mm培养皿的盖子覆盖。
- 对芯片进行成像，以确保膜和孔口无碎屑和/或气泡。在我们的实验室中，我们使用直立显微镜和20倍长工作距离物镜。
- 如果存在碎屑和/或气泡，需反复冲洗流体通道和顶部小瓶。若无法清除碎屑和/或气泡，则丢弃该芯片。
- 芯片成像完成后，将其放回层流罩中，并拔出管路两端的塞子。
- 将管路的一端连接至装有生理培养基的加压注射器。
- 使用止血钳夹紧管路的输出端。
- 打开压力阀，移除流体管路输出端的止血钳，并用生理培养基冲洗流体通道。
- 为用生理培养基冲洗地下流体通道，打开开关阀并移除管路输出端的止血钳。
- 为迫使生理培养基经孔口向上流动，使用止血钳夹紧管路的输出端。
- 使用止血钳夹紧管路的输入端，并关闭开关阀。
- 将管路的输入端从注射器上拆下，并用玻璃塞堵住管路两端。
- 移除止血钳。
- 从顶部小瓶中移除水。
- 用过滤除菌的生理培养基填充顶部小瓶。
- 将芯片重新放回100 mm培养皿中。
- 将一个35 mm培养皿的底部放入100 mm培养皿中，并加入过滤除菌的去离子水以提高湿度。
- 盖上培养皿，直至准备接种细胞时再打开。
4. 蜗牛神经元的细胞铺板
膜片钳芯片可能适用于多种样本制备。我们目前正在使用哺乳动物原代皮层神经元测试我们的芯片，并已获得培养14天细胞的初步结果7，表明我们的灭菌方案是充分的，且芯片在长期培养中无细胞毒性。在本实验方案中，选择蜗牛神经元是因为它们是研究神经元电生理学的一个简单但已被广泛认可的模型11，且迄今为止我们所获得的最重要结果均来自这些细胞10。详细的细胞分离与培养步骤此前已有描述12, 13。
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去除2-3个月大幼虫的外层外壳 Lymnaea stagnalis 用钝头镊子夹住并麻醉动物 Lymnaea 含10%李施德林的生理盐水
所有后续步骤均在室温下，于超净工作台内使用无菌解剖器械和溶液进行无菌操作。 - 用适当的记录溶液替换流体系统中的生理介质使用 一个Eppendorf移液器。在以下情况下 Lymnaea 神经元溶液中含有（单位：mM）：50 KCl，5 MgCl2，5 乙二醇双（氧乙烯基亚硝基）四乙酸（EGTA）和 5 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES；pH 7.4；130 mOsm）14
- 将蜗牛固定在盛有Sylgard的培养皿中 Lymnaea 生理盐水灌注并按前述方法完整取出脑组织 13
- 在定义培养基（DM）中用胰蛋白酶（0.2% 溶液，Sigma，货号 # T-9201）处理分离的脑组织 18 分钟，随后在 DM 中加入胰蛋白酶抑制剂（Sigma，大豆来源，货号 # T-9003）处理 15 分钟。
- 将脑组织固定于盛有高渗定义培养基（HODM - DM 中添加葡萄糖）的小型硅胶培养皿中； 750 μL 将1 M葡萄糖溶液加入至20 mL DM中。
- 使用精细镊子和解剖剪，剥离目标神经节的外层和内层鞘膜，暴露神经元。
- 使用装有HODM并连接至微量注射器的火焰抛光玻璃移液管，对目标细胞（左侧足背神经元1）附近施加轻柔负压，直至该神经元从脑组织上脱离并悬浮于移液管中。
- 然后将玻璃移液管移动并浸入各个神经芯片中，通过微量注射器轻轻推出，使神经元被缓慢推出移液管，并置于芯片上各个记录孔的上方。
- 让细胞在室温下静置至少2小时，以促进其附着在孔周围芯片表面。
5. 电生理记录
将芯片连接至放大器（本实验中使用的是 Molecular Devices 公司位于美国加利福尼亚州福斯特城的 Multiclamp 700B 放大器）
- 用适当的记录溶液替换地下流体系统和芯片小瓶中的溶液。对于Lymnaea神经元，上部培养室中加入Lymnaea生理盐水（单位：mM，含51.3 NaCl、1.7 KCl、4 CaCl2和1.5 MgCl2），并用HEPES缓冲至pH 7.9。14
- 为确保稳定性，将芯片粘附于载玻片上，并置于显微镜下。
- 为将芯片连接至放大器（本实验使用Multiclamp 700B放大器，Molecular Devices，Foster City，CA，USA），剪断一段导管末端，插入一根与前置放大器相连的银丝。
- 将参比电极置于芯片的上部小瓶中。
- 此时芯片已准备就绪，可进行记录。
- 通过放大器施加5 mV阶跃电压，测量总电阻（Rt），以确定神经元的封接状态：细胞贴附式（Rt > 1 GΩ）；全细胞记录式（Rt = 50–100 MΩ，并伴有电容瞬变，提示膜在孔洞处破裂）；或未形成封接（Rt < 5 MΩ）。在我们最近的一组实验中10，58%的细胞形成了高阻封接，其中80%的细胞表现出可兴奋性反应。
6. 代表性结果
- 对神经元（此处为 LPeD1）施加去极化电流脉冲（以 20 pA 为增量）。
- 将神经元的膜电位（Vm）钳制在其静息电位附近（约 -60 mV）。
- 观察神经元对这些去极化脉冲的反应。若神经元具有活性，应能观察到超射型动作电位。
- 图 4 展示了一个代表性结果，相关细节见文献14, 15中的讨论。
图 4. LPeD1 神经元对一系列分级的细胞内电流脉冲（下方）所表现出的电压响应（上方）。电流脉冲施加于膜电位 Vm = -60 mV 时。
问题排查
- 铺板前，对芯片成像以确定膜和孔径是否无碎片且适合铺板。我们使用 upright 显微镜和 20x 长工作距离物镜。在我们最近的一组实验中1，67% 的芯片以此方式成功完成预处理。
- 若存在碎片和/或气泡，则丢弃该芯片并尝试另一片。
- 可尝试多种表面处理（如等离子处理）或涂层（如 PDL、PEI 等），但成功率可能高度依赖于所使用的细胞类型。
- 流体（“移液”）溶液的成分对吉欧欧姆密封（giga-seal）和全细胞状态的形成至关重要。调整溶液时需注意渗透压、pH 值和离子组成。
- 对于较长期的培养，开始时在微流控通道中使用培养基，然后通过重力驱动的温和灌流（约 0.5 ml/min）在记录前切换为移液溶液。
讨论
NRCC 的膜片钳芯片检测平台可能成为一种强大的工具，用于高信息量的药物检测以及体外疾病模型的研究。in vitro 与玻璃移液管相比，其优势在于具有较低的接入电阻，这有利于检测大细胞；尽管电容略大，但对于小细胞仍可实现相当的动力学性能。细胞与芯片孔之间的自发封接已可常规获得，且已观察到全细胞记录的自发形成14。芯片技术与玻璃移液管方法之间的一个明显区别在于，探针本身就是细胞培养皿的一部分，无需手动将其与细胞膜接触。将细胞（可能构成功能性网络的一部分）在培养皿中进行培养，可建立更具生物学相关性的疾病模型，并通过不同的机制实现细胞与探针之间的高密封电阻16。然而，与细胞悬液不同，无法通过负压吸引将细胞定位至探针上。对于蜗牛神经元等较大的细胞，可通过手动方式将其置于探针上方。而对于需要较长培养时间的小细胞，我们通过在探针表面图案化黏附性多肽，使细胞自然定位在探针上方，从而避免了任何人工操作，并显著提高了形成封接的概率，已证实该方法可实现细胞在探针上的精确定位17,18。
国家研究理事会加拿大（NRCC）正在开发一种聚酰亚胺微流控膜片钳芯片19，其电容与玻璃移液管相当。该项目的最终目标是研制一种多探针膜片钳芯片，能够以单个离子通道的分辨率，同时监测参与网络活动的多个神经元的电生理活动14。该方法是多电极阵列的一种高分辨率互补技术20。
致谢
作者感谢 CPFC 的 Alexei Bogdanov 在膜片钳芯片制备方面的贡献，以及 Hue Tran、Ping Zhao 和 Matthew Shiu 在组装方面的协助。Naweed Syed 获得了加拿大卫生研究院（CIHR）基金的资助。Collin Luk 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和阿尔伯塔医学研究遗产基金会（AHFMR）研究生奖学金。
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