利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

摘要

介绍了一种用于研究癌症干细胞迁移的分区化微流控装置。该新型平台可构建可存活的细胞微环境，并实现对活细胞运动的显微可视化观察。通过分离出高迁移活性的癌细胞，可用于研究其侵袭性浸润的分子机制，有望为未来开发更有效的治疗策略提供依据。

摘要

在过去的40年中，美国在癌症研究方面投入了超过2000亿美元，但仅使死亡率下降了5%。改善患者预后的重大障碍之一，在于对与侵袭性癌细胞浸润、转移及治疗耐药相关的细胞迁移机制理解不足¹。多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM）是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤²，正是这一难题的典型代表。尽管已采用标准的手术、放疗和化疗手段，患者的中位生存期仍仅为15个月，主要原因在于GBM对邻近脑组织的侵袭性强以及癌症快速复发²。异常细胞迁移机制与肿瘤微环境之间的相互作用，可能是区分癌细胞与正常细胞的关键因素³。因此，要改进针对GBM的治疗策略，必须更深入地理解癌细胞的迁移机制。近期研究表明，GBM中的一小部分细胞亚群——脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell, BTSC）——可能在治疗耐药和复发中起关键作用。目前，关于BTSC迁移能力的潜在机制才刚刚开始被阐明^1,4。

由于视觉检测和几何操作的局限性，传统的迁移实验⁵仅能对整体细胞群体进行定量分析。相比之下，微流控装置由于可与现代显微镜技术兼容并能精确控制微环境^6-9，因而能够实现单细胞水平的分析。

我们介绍了一种利用分区化微流控装置对脑肿瘤干细胞（BTSC）迁移进行详细表征的方法。这些由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的装置将组织培养环境划分为三个相互连接的区域：接种室、接收室和连接微通道。我们对装置进行了优化，使两个腔室均能容纳足够的培养基，从而在4至5天内无需换液即可维持BTSC的活性。将具有高度迁移能力的BTSC最初接种于接种室中，其在通过连接微通道迁移至平行的接收室后得以分离。该迁移过程模拟了癌细胞在脑组织间质空间中的扩散。在数天内持续记录细胞迁移过程中的活细胞相位图像。因此，可将高度迁移性的BTSC分离出来，进行再培养并进一步分析。

对微流控系统进行区室化设计可成为研究脑肿瘤干细胞（BTSCs）及其他癌症干细胞迁移行为的多功能平台。通过结合梯度发生器、流体操控模块、微电极及其他微流控组件，这些装置还可用于药物筛选和疾病诊断⁶。分离出具有强侵袭性的迁移细胞亚群，将有助于深入探究其潜在的分子机制。

方案

1. BTSC 细胞解离

BTSCs 来源于在无血清干细胞培养基中以神经球形式培养的既有细胞培养物，此类培养方法此前已有描述^{10, 11}。

1. 从BTSC来源的神经球制备细胞悬液。将BTSC来源的神经球收集至15 ml锥形管中，在900 rpm条件下离心5分钟。过快的离心速度可能导致神经球剪切或损伤。吸除上清液后，将神经球培养物重悬于0.5 ml预热的Accutase溶液中。在37°C孵育5–10分钟，使神经球松散。用P100移液器轻轻吹打10–20次以机械解离细胞，随后加入1.5 ml干细胞培养基以中和Accutase活性。
2. 将BTSC以1300 rpm离心5分钟，然后重悬于1 ml干细胞培养基中。
3. 从悬液中取出50 μl分装至微量离心管中用于细胞计数。向Eppendorf管中加入50 μl台盼蓝染液，混匀后将悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。
4. 根据细胞计数结果，如需要，可向BTSC悬液中添加额外的干细胞培养基，调整至活细胞密度为20,000个细胞/μl培养基。

2. 双层SU-8模具的制备及PDMS印章的成型（见图1）

我们采用光刻和软光刻技术制备SU-8母模和PDMS印章，这是微流控器件组装的关键步骤。与标准流程略有不同¹²，我们的SU-8母模由两层构成。在工艺早期，先在第一层（底层）浇铸出高3 μm的微通道，而高250 μm的接种室和接收室则位于第二层（上层）。为了确保两个培养区域（微通道与腔室）之间的正确连接，这两层必须精确对准位置。然而，第二层的厚度和不透明性足以阻挡基准标记/光学对准器观察到底层的结构特征。为此，我们设计了将基准标记置于远离主结构的位置。这样，在旋涂第二层时，可选择性地遮蔽第一层中的这些标记。最终，两层结构特征被集成在同一块母模上，可用于PDMS印章的浮雕 molding。

1. 设计并制备两张光刻掩模。第一张掩模包含两个对准标记和一组微通道（400 μm 长，10–50 μm 宽），用于第一层；另一张掩模包含播种腔和接收腔（2 mm 长，600 μm 宽），用于第二层。两张掩模均使用 Illustrator（Adobe，加利福尼亚州）设计，激光打印至透明胶片（Thin Metal Parts，科罗拉多州），并用异丙醇清洗后自然晾干。
2. 根据供应商提供的产品说明书，使用 su-8 光刻胶（MicroChem，马萨诸塞州）制备第一层。首先，在手柄晶圆（WRS Materials，加利福尼亚州）上旋涂 3-μm 厚的 su-8（5）光刻胶，随后进行前烘。然后通过紧贴式紫外曝光和固化，使用对应的掩模进行曝光，再经过后烘和显影处理。
3. 旋涂第二层 250 μm 厚的 su-8（2100）。为防止厚光刻胶遮挡第一层的对准标记，在旋涂第二层前，预先用透明胶带覆盖这些区域。旋涂完成后，将胶带撕去，暴露出对准标记以供后续对准使用。
4. 使用第二张掩模对第二层进行紫外曝光。在对准标记暴露后，可直接利用光学掩模对准仪将其与第二张掩模上的标记对齐。随后对第二层光刻胶进行紧贴式紫外曝光和固化，再进行后烘和显影。
5. 对制得的模具母版进行防粘涂层处理。为便于脱除固化的 PDMS，可通过蒸气沉积法对 su-8 母版进行硅烷化处理，使其表面形成防粘涂层。具体操作为：将母版置于真空干燥器中，并在其中加入数滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷溶液，抽真空处理至少一小时。
6. 使用母版浇铸 PDMS。将 PDMS Sylgard 184（Dow Corning，密歇根州）的预聚体基质与固化剂按 10:1 的比例充分混合，放入真空干燥器中脱气，直至无可见气泡。将混合物浇注到母版上，若引入新的气泡，则再次脱气。将模具置于水平加热板上，在 90 °C 下固化 2 小时。冷却至室温后，轻轻剥离 PDMS 印模。此时，细胞培养通道已成型于 PDMS 中，可进行器件组装。母版可重复使用，直至出现裂纹或磨损；当表面重新出现粘性时，需再次进行防粘涂层处理。

3. 微流控装置的组装与细胞培养（图2）

为了培养细胞，需将带有微结构的PDMS印章固定在玻璃盖玻片上，以形成封闭的通道。通过设置入口和出口来加载培养基或细胞。同时，必须对玻璃基底和PDMS印章进行清洗及其他预处理步骤，以确保其具备细胞相容性。

1. 使用穿孔活检打孔器通过PDMS印章制作储液池。我们选择其直径为6 mm。这些储液池具有两个用途：一是用于储存额外的营养物质以支持细胞生长；二是便于移液器加样和真空抽吸操作。
2. 将PDMS印章浸泡在70%乙醇中30分钟，然后用去离子水冲洗10分钟。目的是清除在制造过程中可能引入的有机残留物以及未交联的PDMS污染物。其他研究中曾采用更强烈且更彻底的清洗方法，如有机溶剂萃取¹³和索氏提取¹⁴，但在BTSC培养中我们发现这些步骤并非必要。
3. 使用高压灭菌器（121°C，35分钟）对PDMS印章进行灭菌。此步骤可进一步完成PDMS的交联反应。从本步骤开始至步骤3.6，所有操作均需以无菌方式进行。
4. 将PDMS印章放置于预先涂覆多聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上^15-17。随后通过在通道中加入层粘连蛋白溶液并在37°C孵育过夜，使装置表面包被层粘连蛋白。之后从装置中抽吸去除层粘连蛋白溶液，并用干细胞培养基清洗装置。
5. 将步骤1中制备的细胞悬液加入储液池和通道中。在其中一个接种储液池中加入11 μl解离后的细胞悬液。如有需要，可使用真空抽吸促使细胞进入接种腔。在相邻的另一个接种储液池中额外加入7 μl细胞悬液。注意：平均细胞密度为20,000个细胞/μl培养基。五分钟后，在接种储液池和接收储液池中加满培养基。
6. 在顶部覆盖一层0.5–1 mm厚的预先高压灭菌PDMS片。两片PDMS之间自然形成的表面粘附作用将使细胞培养装置密封，从而可用于运输、培养及显微成像。

4. 使用 BioStation IM（Nikon Instruments Inc, Melville, USA）对 BTSC 迁移进行长期延时成像。

将相机、软件和培养箱全部集成于一个设备中，该显微系统可实现对细胞培养连续数天无干扰成像。此外，其独特的电机设计在点位扫描功能中移动物镜，同时保持样品载物台静止不动，使得在高通量实验中对平行实验进行成像以及追踪细胞运动成为可能。

1. 将Biostation IM预平衡45分钟，以稳定温度、湿度和空气供应。在样品室中放置数个含水培养皿，以维持适当的湿度。
2. 将含有细胞的装置放入显微镜的样品室中，并使用微型镊子将其居中定位。
3. 在Biostation软件中设置焦距、位置点和时间点，然后启动延时成像。

5. 代表性结果：

利用分区微流控装置对癌细胞迁移进行目视检查和表征的示例如图3和图4所示。所用细胞系为BTSC。在当前实验设置下，可对细胞培养过程进行连续相差成像，最长可达5天（图3），最频繁可每2秒采集一次图像（图4）。超过5天后，需更换培养基以补充营养物质并清除代谢废物。通过长期延时成像，我们根据形态学变化识别出细胞迁移过程中呈现的六个阶段性循环。如图3所示，这六个阶段依次为：（i）迁移前阶段、（ii）启动阶段、（iii）路径探索阶段、（iv）巡航阶段、（v）目的地探索阶段和（vi）迁移后阶段。在接收腔中，纺锤形细胞处于阶段（i），类似于实体瘤中的细胞，能够生长、分裂并逐渐迁移。当细胞接近微通道入口时，少数细胞进入阶段（ii），此时细胞体积扩张并产生黏附性突起。通常仅有一个细胞能够占据入口并进入阶段（iii），在此阶段探索迁移方向。一旦细胞确定迁移方向，便进入阶段（iv），以稳定且高速的状态穿越整个微通道。到达微通道末端后，细胞进入阶段（v），探索接收腔的开放空间，随后进入阶段（vi）。在微通道内，迁移动力主要由细胞出泡（blebbing）活动产生，如图4所示，其机制类似于阿米巴样细胞。细胞出泡及膜形变过程在此均被完整记录。

图1. 微流控器件制备示意图。整个过程在一片3英寸硅衬底上通过改进的软光刻技术完成。第一层制作出3 μm高的微通道和对准标记。随后，在保留对准标记区域用透明胶带覆盖的条件下，旋涂一层250 μm厚的SU-8，以确保后续对准标记仍可被掩模对准仪识别，避免厚光刻胶遮挡视线。由此可在第二层精确对准第一层的位置上制作腔室结构。最终，从所获得的模具上复制出PDMS印章。

图2. 装置组装及细胞接种过程示意图。三维培养空间由PDMS和玻璃盖玻片封装而成，包含腔室、储液池和微通道。接种腔中充满细胞培养液，而接收腔初始时充满无细胞培养基。连接两者的微通道为细胞从接种侧向接收侧迁移提供了迁移路径。

图3. BTSC通过微通道的迁移过程。上图：延时成像快照显示单个细胞（以绿色高亮）从接种侧迁移超过400 μm到达接收侧。整个迁移过程约持续2天，期间经历一系列细胞形态学变化。比例尺为40 μm。下图：迁移六个阶段的示意图。迁移前（i）：在接种室中，纺锤形且具有分裂能力的细胞逐渐彼此沿同一方向迁移。靠近微通道入口的细胞通过极化细胞体并伸出片状伪足相互竞争。启动（ii）：迁移能力最强的细胞占据通道入口，而其他竞争细胞则退缩。路径探索（iii）：迁移细胞转变为低极性的阿米巴样模式。该迁移模式具有极强的运动性，可通过出泡形成小的膜突起向各个方向探索路径。巡航（iv）：一旦确定迁移路径，细胞会通过维持一个较大的向前突起转变为适应性阿米巴样模式。由此，细胞保持高运动性的同时也具备稳定的方向和速度。目的地探索（v）：到达路径末端时，细胞运动减慢，并形成丝状伪足以探索接收室中是否存在侵袭靶点。迁移后（vi）：进入接收室后，细胞转变为星形，仍保持高运动性，但无明确迁移方向。

图 4. 时间推移成像的快照显示了BTSC细胞出泡活动及膜变形的周期：(A-B) 起始阶段；(B-D) 扩展阶段；(D-F) 回缩阶段。箭头和曲线分别表示膜变形的方向和位置。快照每8秒采集一次。

讨论

本文介绍的微流控装置和图像记录技术可实现对细胞迁移过程中细胞形态的可视化表征。与现有的传统方法相比，该微流控平台具有成本低、通量高和设计灵活等优势。所展示的显微可视化系统可用于长期活细胞迁移过程的研究与记录。镜头电机化功能使得在不干扰样本的情况下，以高图像分辨率追踪多条迁移路径成为可能。

在装置组装过程中，为便于聚-D-赖氨酸（PDL）包被（步骤 3.4），聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章会暂时性地与玻璃盖玻片键合。实现良好的密封对于本方案的成功至关重要。装置制备过程中引入的污染，例如印章中的气泡或基底上的灰尘/碎屑，可能破坏键合效果并导致液体泄漏。因此，以无尘方式处理装置对于防止装置失效非常重要。在进行 PDL 包被前，玻璃盖玻片需经硝酸处理，PDL 溶液需经离心处理，以去除灰尘/碎屑。若不具备洁净室条件，我们发现使用透明胶带、酒精冲洗和水浴对清除 PDMS 印章上的灰尘/碎屑非常有帮助。在 PDMS 印章与玻璃盖玻片接触后，用镊子轻轻敲击印章有助于实现密封。

可通过干细胞培养基中的成球培养法，从人手术室标本中富集脑肿瘤干细胞（BTSCs），该方法类似于正常神经干细胞的培养方法¹⁰。以此方式富集的BTSCs表现出类似干细胞的特性，例如表达干细胞标志物（CD133、nestin）、向多种神经谱系（胶质细胞和神经元）分化，以及在原位免疫缺陷小鼠模型中仅需100个细胞即可启动肿瘤形成¹⁸。尽管目前对于BTSCs的纯化与维持仍存在一些争议^{1, 19-21}，但成球培养的BTSCs能更好地保持亲本肿瘤的表型和基因型^22-24。

这种分隔的空间模拟了细胞迁移的生理环境。在我们的装置中，脑肿瘤干细胞（BTSC）通过调节细胞形态，表现出穿越尺寸受限空间的强迁移能力。我们对细胞形态变化的表征揭示了一种六阶段序列中的模式转换，可能为BTSC侵袭邻近脑组织提供一种新的、更详细的描述模型。在早期阶段，细胞获得显著的极性，并产生黏附性突起，从而有效地将自身锚定在微通道内。一旦细胞在微通道中占据位置，便会转换为巡航模式，并在整个微通道迁移过程中维持该模式。在此阶段，BTSC保持高运动性和一致的方向性，同时节约能量。有趣的是，一个微通道似乎一次仅允许一个细胞进入巡航状态；当单个细胞进入此阶段时，其他细胞会从微通道中撤退。这种机制可能有助于确保肿瘤扩散的有效性，并防止微通道内营养物质的过度消耗。在完成穿越微通道的迁移后，细胞重新表现出多向突起的倾向，并进一步探索侵袭靶点或新的迁移路径。这种具有空间分隔的微流控装置为体外研究BTSC对脑实质的浸润提供了一种新颖的微环境构建方法。

该方法可轻松适用于其他肿瘤类型来源的肿瘤干细胞（CSC）和迁移性细胞系的研究。在配备有培养箱和组织培养技术的现代生物学实验室中，均可开展在微流控装置中培养细胞的实验。只要具备SU-8模具母版，经过基本的软光刻技术培训后，即可完成PDMS浇铸和装置组装。此外，通过整合其他功能模块（如梯度混合器、表面图案化、流体控制和微电极），该平台还可拓展用于其他应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’高糖DMEM培养基	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11965	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
火腿’s F12	GIBCO，隶属于 Life Technologies	31765	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
B27添加剂（不含维生素A）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	12587-010	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
抗生素-抗真菌素（PSA）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15240	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
表皮生长因子（EGF），人重组	GIBCO，隶属于 Life Technologies	PHG0313	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），人重组	GIBCO，隶属于 Life Technologies	PHG0021	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
肝素钠盐（源自猪肠黏膜）	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
层粘连蛋白（天然小鼠）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	23017-015	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养用品
Accutase	EMD Millipore	SCR005	脑肿瘤干细胞（BTSC）培养所需材料
干细胞培养基			30 % Hams F12 70% DMEM <李>1% 抗生素-抗真菌剂<李>2% B27（不含维生素A）<李>EGF（20 ng/mL）和 bFGF/肝素（20 ng/mL bFGF，5 mg/mL 肝素）：混合各组分，使用前经无菌过滤
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）/肝素			分装浓度 20 μg/ml <李>对于25 μg：向25 mL中加入1.25 mL浓度为5 mg/mL的肝素 μbFGF。<李>对于250 μg：向250中加入1 mL 5 mg/mL肝素溶液 μg bFGF。转移至15 mL锥形管，加入11.5 mL浓度为5 mg/mL的肝素至锥形管中。 <李>储存为50 μ升或250 μ-80℃下分装保存°C.
表皮生长因子（EGF）			<李>分装浓度 20 μg/ml<李>对于200 μg：向200中加入1 mL无菌DMEM（Gibco 11965-118） μg EGF。转移至15 mL锥形管，加入9 mL DMEM。<李>500 μg：向200加入1 mL无菌DMEM（Gibco 11965-118） μg EGF。转移至50 mL锥形管，加入24 mL DMEM。 储存为50 μ升或250 μ-80 下分装保存°C.
肝素			<李>分装浓度 5 mg/ml<李>称取100 mg肝素。<李>将100 mg肝素加入20 mL（70%）DMEM-（30%）F12-（1%）PSA（14 mL DMEM，6 mL F12，200 μL PSA<李>无菌滤器<李>储存为50 μ升或250 μ-80 下分装保存°C
SU-8 光刻胶	MicroChem 公司
硅衬底晶圆	WRS 材料	3P01-5SSP-INV
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	道康宁
层粘连蛋白	BD 生物科学		50 μPBS缓冲液中以达到最终浓度 g/ml
Biostation IM	尼康仪器公司