改变电脉冲施加过程中电场的方向和取向可提高体外质粒基因转导效率 in vitro

摘要

在脉冲施加过程中改变电场方向，可使电穿孔介导的基因转染效率提高约两倍，同时不影响细胞活力。基因转染效率的提升是由于细胞膜上具备DNA进入能力的区域面积增加所致。

摘要

基因电转移是一种通过施加短暂而强烈的电脉冲将基因导入细胞的物理方法，这些电脉冲会导致细胞膜失稳，使其对小分子具有通透性，并允许DNA等大分子进入细胞。由于其安全性高、效率好且操作简便，该方法是病毒载体的一种有效替代方案。为了实现最大化的基因转染效果，基因电转移中采用不同的电脉冲方案，其中之一是在电脉冲施加过程中改变电场的方向和取向。改变电场的方向和取向可增加细胞膜上适于DNA进入的区域面积。在本视频中，我们展示了在所有电脉冲均沿同一方向施加与交替改变电场方向和取向施加电脉冲两种情况下，基因电转移效率的差异。为此，使用了集成电极的电转头和一种高压原型发生器，后者可在施加电脉冲期间实现电场方向的切换。基因电转移效率通过脉冲施加24小时后表达绿色荧光蛋白的细胞数占总细胞数的比例来确定。结果表明，在电脉冲施加过程中改变电场取向可提高基因转染效率。

方案

1. 实验用细胞培养、质粒及缓冲液的准备

1. 本实验使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）。细胞在添加了2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、400 µl/l 庆大霉素（以上均来自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德国德森霍芬）和1 ml/l 羧苄西林（Pliva，克罗地亚萨格勒布）的营养液HAM-F12（PAA）中培养。细胞置于37°C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养24小时。
2. 在大肠杆菌DH5α菌株中扩增编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pEGFP-N1（Clontech Laboratories Inc.，美国加利福尼亚州山景城），并使用HiSpeed质粒大提试剂盒（Qiagen，德国希尔登）进行提取。质粒DNA浓度（溶于TE缓冲液中的质粒）应通过260 nm处的分光光度法测定，并通过凝胶电泳确认。
3. 配制等渗磷酸钠缓冲液（10 mM Na₂HPO₄，10 mM NaH₂PO₄，1 mM MgCl₂，250 mM 蔗糖，pH 7.4）。
4. 实验当天，用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德国德森霍芬）进行消化制备细胞悬液。在4°C条件下，以1000 rpm（180 × g）离心5分钟（Sigma，德国），将细胞沉淀重悬于等渗磷酸钠缓冲液中，调整细胞密度至5 × 10⁶ 个细胞/ml。

2. 硬件设备

1. 细胞被置于带有集成电极的移液管尖端（图1）中的电场内，电极连接至一台高压原型发生器。该尖端与电极的几何结构可实现相对均匀的电场施加，且发生器能够提供不同方向的电脉冲。该移液管尖端与发生器由卢布尔雅那大学电气工程学院生物控制论实验室研制¹。

图1. 带集成电极的移液器吸头的垂直与水平（a）截面图及实物照片（b）。截面图中，灰色表示塑料外壳，黑色表示电极。带集成电极的移液器吸头包含四个圆柱形棒状电极。电极由不锈钢制成，直径为1.4 mm，相邻电极间距为1 mm，相对电极间距为2 mm。电极平行粘接于塑料吸头内，有效长度为30 mm ²。

3. 基因电转移实验方案

1. 将质粒 pEGFP-N1 以 10 μg/ml 的浓度加入细胞悬液中。
2. 在施加电脉冲前，于室温下孵育混合物 2-3 分钟。
3. 用带有集成电极的移液枪头吸取 100 µl 细胞悬液。
4. 为达到最佳基因电转移效率并维持细胞活力，应使用优化的电脉冲参数。本实验中，使用高压原型发生器对每个样品施加一串 8 个矩形脉冲（每个脉冲持续时间为 1 ms，幅度为 225 V，重复频率为 1 Hz）。采用两种不同的电场方案（图 2）：在第一种方案中，所有脉冲均沿同一方向施加；而在第二种方案中，脉冲通过交替改变电场方向和取向施加。第二种方案仅可在配备支持不同方向施加电脉冲的适当脉冲发生器时使用。
5. 电脉冲处理后，立即将细胞从移液枪头转移至 6 孔板中，并加入胎牛血清（FCS-Sigma, USA）（体积为样品的 25%）。
6. 将细胞在 37°C 下孵育 5 分钟，以使细胞膜重新封闭。
7. 向 6 孔板中的每个样品加入 2 ml HAM-F12 培养基，并在 37°C、湿润的 5% CO₂ 环境中孵育细胞 24 小时。

图2. 电场刺激方案：（a）所有脉冲均沿同一方向施加；（b）通过交替改变电场的方向和取向来施加脉冲。

4. 图像采集与基因电转移效率的测定

1. 基因电转移效率通过脉冲施加后24小时表达GFP的细胞百分比来确定。
2. 使用荧光显微镜（本实验采用Zeiss 200, Axiovert, ZR Germany）观察细胞，激发光由单色器系统（PolyChrome IV, Visitron, Germany）产生，波长为488 nm，发射光检测波长为507 nm。图像通过成像系统（MetaMorph imaging system, Visitron, Germany）采集，但也可使用其他类似的图像获取软件。
3. 在20倍物镜放大倍数下至少采集五张图像（相差图像和绿色荧光图像）。
4. 在相差图像中计数总细胞数，在绿色荧光图像中计数表达GFP的细胞数。通过将表达GFP的细胞数除以对应图像中的总细胞数，计算基因电转移效率的百分比（图3）。

5. 代表性结果：

图3. 显示了在所有电脉冲均沿同一方向施加，以及交替改变电场方向和取向施加电脉冲时，表达GFP的细胞百分比。细胞接受了一组八个脉冲，脉冲幅度为225 V，持续时间为1 ms，重复频率为1 Hz。结果通过荧光显微镜获得。图中每个数值代表三次独立实验的平均值±标准差。通过交替改变电场的方向和取向，表达GFP的细胞百分比增加。

讨论

基因电转移是一种多功能的生物技术，通过施加短暂的高电压电脉冲将DNA导入细胞³，由于其安全性高、效率良好且操作简便，是病毒载体的一种更安全的替代方法。尽管目前基因电转移已广泛用于转染各类细胞，并已有首个采用该方法的I期临床试验报道⁴，但其潜在的作用机制尚未完全阐明。已知的是，当对细胞施加足够强度的电脉冲时，会引起跨膜电位升高，从而导致细胞膜失稳⁵。细胞膜通透性因此增加，使原本不能透过膜的分子得以进入细胞。已有大量参数被描述^6-9，可影响基因电转移的效率，尤其是不同电脉冲参数的应用已被广泛研究，以提高基因转移效果^10-12。在脉冲递送过程中改变电场方向和取向，可扩大细胞膜的可渗透区域¹³，从而增加可用于DNA分子转移的有效区域。研究表明，在电脉冲施加过程中交替改变电场方向和取向，可提高表达所转移基因的细胞比例¹⁴。为此，必须使用能够施加不同方向电脉冲的电脉冲发生器¹。我们采用此类脉冲发生器以及集成电极的移液器吸头，以演示在所有脉冲均沿同一方向施加，与交替改变电场方向...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HAM-F12	PAA Laboratories	E15-016	培养基
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
胎牛血清	PAA Laboratories	A15-151
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1397	抗生素
结晶霉素	Pliva	625110	抗生素
pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1	质粒DNA
HiSpeed 质粒大提试剂盒	Qiagen	12662
Na2HPO4	Merck & Co., Inc.	F640786 933
NaH2PO4	TKI Hrastnik	0795
MgCl2	Sigma-Aldrich	M-8266
蔗糖	Sigma-Aldrich	16104
胰蛋白酶/EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4174
移液器吸头	定制
电脉冲发生器	定制
6孔板	Techno Plastic Products	92406
15 ml 离心管	Techno Plastic Products	91015
75 cm2 培养瓶	Techno Plastic Products	90076