在脉冲施加过程中改变电场方向，可使电穿孔介导的基因转染效率提高约两倍，同时不影响细胞活力。基因转染效率的提升是由于细胞膜上具备DNA进入能力的区域面积增加所致。
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本文内容
摘要
摘要
基因电转移是一种通过施加短暂而强烈的电脉冲将基因导入细胞的物理方法，这些电脉冲会导致细胞膜失稳，使其对小分子具有通透性，并允许DNA等大分子进入细胞。由于其安全性高、效率好且操作简便，该方法是病毒载体的一种有效替代方案。为了实现最大化的基因转染效果，基因电转移中采用不同的电脉冲方案，其中之一是在电脉冲施加过程中改变电场的方向和取向。改变电场的方向和取向可增加细胞膜上适于DNA进入的区域面积。在本视频中，我们展示了在所有电脉冲均沿同一方向施加与交替改变电场方向和取向施加电脉冲两种情况下，基因电转移效率的差异。为此，使用了集成电极的电转头和一种高压原型发生器，后者可在施加电脉冲期间实现电场方向的切换。基因电转移效率通过脉冲施加24小时后表达绿色荧光蛋白的细胞数占总细胞数的比例来确定。结果表明，在电脉冲施加过程中改变电场取向可提高基因转染效率。
方案
1. 实验用细胞培养、质粒及缓冲液的准备
- 本实验使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）。细胞在添加了2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、400 µl/l 庆大霉素（以上均来自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德国德森霍芬）和1 ml/l 羧苄青霉素（Pliva，克罗地亚萨格勒布）的营养混合液HAM-F12（PAA）中培养。细胞置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
- 在大肠杆菌DH5α菌株中扩增编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pEGFP-N1（Clontech Laboratories Inc.，美国加利福尼亚州山景城），并使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒（Qiagen，德国希尔登）进行提取。质粒DNA浓度（溶于TE缓冲液中的质粒）应通过分光光度法在260 nm处测定，并通过凝胶电泳确认。
- 配制等渗磷酸钠缓冲液（10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，1 mM MgCl2，250 mM 蔗糖，pH 7.4）。
- 实验当天，用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德国德森霍芬）进行消化制备细胞悬液。在4°C条件下以1000 rpm（180 × g）离心5分钟（Sigma，德国），将细胞沉淀重悬于等渗....
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讨论
基因电转移是一种多功能的生物技术，通过施加短暂的高电压电脉冲将DNA导入细胞3，由于其安全性高、效率良好且操作简便，是病毒载体的一种更安全的替代方法。尽管目前基因电转移已广泛用于转染各类细胞，并已有首个采用该方法的I期临床试验报道4，但其潜在的作用机制尚未完全阐明。已知的是，当对细胞施加足够强度的电脉冲时，会引起跨膜电位升高，从而导致细胞膜失稳5。细胞膜通透性因此增加，使原本不能透过膜的分子得以进入细胞。已有大量参数被描述6-9，可影响基因电转移的效率，尤其是不同电脉冲参数的应用已被广泛研究，以提高基因转移效果10-12。在脉冲递送过程中改变电场方向和取向，可扩大细胞膜的可渗透区域13，从而增加可用于DNA分子转移的有效区域。研究表明，在电脉冲施加过程中交替改变电场方向和取向，可提高表达所转移基因的细胞比例14。为此，必须使用能够施加不同方向电脉冲的电脉冲发生器1。我们采用此类脉冲发生器以及集成电极的移液器吸头，以演示在所有脉冲均沿同一方向施加，与交替改变电场方向.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由斯洛文尼亚研究署（项目 J2-9770、基础设施中心 IP-0510 和项目 P2-0249）资助。本视频是斯洛文尼亚卢布尔雅那大学电气工程学院主办的“电穿孔技术与治疗”科学研讨会及研究生课程的补充材料。作者还感谢 Duša Hodžič 慷慨提供质粒 DNA。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | 培养基 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 胎牛血清 | PAA Laboratories | A15-151 | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1397 | 抗生素 |
| 结晶霉素 | Pliva | 625110 | 抗生素 |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | 质粒DNA |
| HiSpeed 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| 移液器吸头 | 定制 | ||
| 电脉冲发生器 | 定制 | ||
| 6孔板 | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml 离心管 | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 培养瓶 | Techno Plastic Products | 90076 |
参考文献
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for sma....
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