躯干神经嵴细胞迁移使用一个修改过的Zigmond室法分析

Summary

取出的细胞迁移（躯干神经嵴细胞）的方法来分析。这种方法是廉价的，温柔的，和能够区分趋化学增活现象和其他因素的影响，如在主躯干神经嵴细胞培养的细胞 - 细胞相互作用所产生的迁徙极性的。

Abstract

神经嵴细胞（NCCS）是一个流动人口的细胞存在于脊椎动物的发展，移民从背神经管（NT）后发生上皮-间质转化^1,2。在EMT，NCC的长距离迁移，沿刻板的途径，直到他们达到他们的目标。 NCC的区分成为一个巨大的数组类型的细胞，包括神经元，神经胶质细胞，黑素细胞和嗜铬细胞^1-3。 NCC的接触和认识到自己的正确的目标位置的能力是基本适当的主干NCC-源性成分结构的形成。因此，阐明机制的指导主干NCC迁移的问题具有十分重要的意义。大量的分子已被证明来指导NCC迁移^4。例如，躯干NCC的Semaphorin，和ephrin和缝配体的^5-8负指导线索，如被击退。然而，并非直到最近，已确定^9的任何趋化因子的主干NCC的。

常规的体外方法研究的贴壁细胞的趋化行为的工作最好与永生化的，均匀分布的细胞，但更具挑战性的适用于某些初级最初缺乏均匀的分布和迅速分化（如NCC的）的干细胞培养。均匀化分布的主干NCC的趋化研究的一种方法是从小学NT植文化的主干NCC的隔离，然后抬起replate他们几乎100％汇合。然而，这种电镀的方法需要大量的时间和精力，到取出足够的细胞，是残酷的，分布躯干的NCC的在一个不同的方式，发现在体内条件。

在这里，我们报道了在体外的方法，是可以评估的趋化和其他迁徙的主干NCC的回应没有requirin嘎同质细胞分布。此技术利用延时成像伯，泰然自若改性Zigmond室（一个标准Zigmond室其他地方描述^10）内的中继线净捐助国。通过暴露在培养的周边的中继线净捐助国到趋化梯度是垂直于他们的预测的自然方向性，由所施加的趋化梯度诱导洄游极性的改变可以被检测。这种技术是廉价的，需要只有两个NT外植体每重复处理的培养，避免恶劣的细胞起重（如胰蛋白酶消化），叶中继线NCC的在一个更相似的分布，在体内条件下，外植和实验之间的时间量减少（这可能会降低分化的风险），并允许时间的推移众多的候鸟特性的评价。

Protocol

1。第1天:过夜培养于盖玻片上的躯干神经管分离

1. 56小时的孵育小鸡的鸡蛋在38℃中取出的鸡蛋孵化，轻度喷用70％的乙醇，然后让他们干。将鸡蛋打碎成紫外线消毒的玻璃盘。
2. 从每个胚胎中提取蛋黄，将其放置在小鸡林格氏。通过第一弯剪刀切割周围血岛，然后，用生硬的镊子，挑胚胎的胚外膜，并将其放置在无菌塑料培养皿中含有小鸡林格氏液。
3. 隔离每个胚胎的树干修剪多余的胚外膜以及颅，迷走神经，骶轴向水平，使用钨针（图1）。首先，选择约9胚胎阶段之间HH15-17 ^11。对于阶段HH15和，前脑和后脑轴形成一个锐角，因此出现的头部倾斜尾端。在阶段HH17，尾芽和倾斜腹部，但不包含体节。有了一个钨针，修剪掉至约2毫米的胚外膜从胚胎和切断前的体节10任何胚胎组织。同时删除所有的尾部的胚胎组织从周围的第五个新形成的体节。
4. 将孤立胚胎中继线在中性蛋白酶（0.24 U / ml的DMEM培养基）孵育1小时15分钟，在37℃和5％CO _2的 。树干一旦开始孵化，开始准备6的盖玻片（CS）培养NT植（步骤1.5-1.8）。
5. 冲洗6在70％乙醇中的CS（在无菌水，超纯水稀释），然后允许它们干燥。使用实验室的标记，画一个圆圈，在每个CS的中心是直径在1厘米左右（这个圈子以后可以帮助您确定已应用于纤维连接蛋白涂层）。在同一个面上的每一个CS，写的字"是"（或其他一些非对称的字或形状）绘制的圆外（这将有助于ŸOU识别是否正面临着显着的CS....

Discussion

在主干NCC的趋化研究已经证明了具有挑战性的一系列原因。主干的NCC的构成一个异构干细胞的人口将分化，如果培养长期的，因此，躯干NCC的，必须从主外植的中继级NT。传统的方法来研究均匀分布在体外的细胞群的趋化反应是难以在主干NCC的测试，因为他们首先需要的细胞是孤立的均匀再接种的趋室（例如，Boyden小室^12）。为外植几十个NTS可能会被要求创建一个均匀分布的主干NCC的，足够的，甚至一个实验隔离足够NCC的可能是很乏味的。此外，NCC的都没有抬，混合，均匀重新分配他们的自然背景。因此，NCC的行为可能以执行某些常规趋化实验，再接种完全不同的在体内条件在迁徙行为方面。

在这里，我们描述一个技术评估主干NCC趋化以一种更自然的情况下。一个主要的挑战进行评估时，没有一个均匀分布的趋化反应的主干NCC的是NCC的内原有的外植体培养，除了他们天生的异类身份的强烈固有的极性。例如，躯干NCC的倾向主要是垂直迁移（客场）从NT时，在文化^13。的各种影响因素，树干NCC内的外植体培养的极性可以如此强大，它是很难最后.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
DMEM	欧米茄科学	DM-22
青霉素链霉素解决方案中	欧米茄科学	PS-20	100X股权集中度
L-谷氨酰胺	欧米茄科学	GS-60	100X股权集中度
胎牛血清	欧米茄科学	FB-11	地段＃105247（或其他相媲美）
修改Zigmond室	自制	N / A	水库容积:160微升EA;其他规格，请参阅图。 4，补充制造协议
细胞培养皿	丹维尔	T6040	40×10毫米
纤维连接蛋白	BD	354008	10倍的股票准备在1毫升H 2 O和9毫升DMEM稀释1毫克FN
盖玻片	费舍尔	12-548-B	预清洗; 22 x 22毫米
L15介质	Thermo Scientific的	SH30525.02
凡士林	舒适	011110794642	100％
离心管	Biologix	10-9152	15毫升
中性蛋白酶	电池系统	4Z0-850	10X股权集中度
注射器	BD	309602	1毫升
针	BD	305127	25 G x 1.5英寸
的Alexa Fluor 488-IgM阳性	我nvitrogen	A21042	股票是2毫克/毫升; 7摩尔的染料/摩尔IgM抗体
解剖镊	FST	杂项。	杜蒙特＃5或55;直嘴;不锈钢或钛
钨针	N / A	N / A	首页放置在针座
钝钳	蒂曼	160-18	用于转移胚胎林格从蛋黄中的