利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

摘要

本文介绍了一种分析移植细胞（躯干神经嵴细胞）迁移的方法。该方法成本低廉、操作温和，能够区分趋化性与化学趋向性，以及源自原代躯干神经嵴细胞培养中细胞间相互作用等其他因素对迁移极性的影响。

摘要

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物发育过程中存在的一群短暂细胞，它们在经历上皮-间质转化后从背侧神经管（NT）迁移而出^1,2。经历EMT后，NCCs沿特定路径长距离迁移，直至到达靶位点。NCCs可分化为多种细胞类型，包括神经元、胶质细胞、黑色素细胞和嗜铬细胞^1-3。NCCs能够抵达并识别其正确靶位点的能力，是所有含有躯干NCC来源组分结构正常形成的基石³。因此，阐明躯干NCC迁移的导向机制具有重要意义。已有大量分子被证实可引导NCC迁移⁴。例如，已知躯干NCC会被Semaphorin、Ephrin和Slit配体等负性导向信号排斥^5-8。然而，直到最近才鉴定出任何躯干NCC的化学趋化吸引因子⁹。

常规的 体外 研究贴壁细胞趋化行为的方法在处理永生化且分布均匀的细胞时效果最佳，但应用于某些初始分布不均且快速分化的原代干细胞培养物（如神经嵴细胞，NCCs）时则更具挑战性。一种实现躯干NCCs分布均一化以用于趋化研究的方法是：从原代神经管（NT）外植体培养物中分离躯干NCCs，随后消化并重新接种，使其达到近100%汇合。然而，这种接种方法需要耗费大量时间和精力以获取足够的外植体细胞，操作过程较为剧烈，且导致躯干NCCs的分布方式与体内自然分布状态存在差异。 体内 条件。

本文报道了一种体外方法，能够在无需均一细胞分布的情况下评估躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性及其他迁移反应。该技术利用改良的Zigmond小室对原代、未受干扰的躯干NCCs进行延时成像（标准Zigmond小室的描述见其他文献¹⁰）。通过在培养物边缘的躯干NCCs暴露于与其预测自然迁移方向垂直的趋化因子梯度，可检测施加的趋化因子梯度所诱导的迁移极性改变。该方法成本低廉，每次重复处理仅需培养两个神经管（NT）外植体，避免了剧烈的细胞解离操作（如胰酶消化），使躯干NCCs保持更接近体内状态的分布，缩短了外植与实验之间的时间间隔（可能降低分化风险），并允许对多种迁移特征进行延时评估。

方案

1. 第1天：分离躯干神经管并接种于盖玻片上进行过夜培养

1. 将鸡胚蛋在56小时条件下孵育 38° C将鸡蛋从孵育环境中取出，用70%乙醇轻微喷洒，然后使其干燥。将鸡蛋打开，放入经紫外灭菌的玻璃托盘中。
2. 用弯头剪刀在血岛周围剪开，然后用钝头镊子夹住胚外膜将每个胚胎从卵黄中取出，放入盛有鸡林格氏液的无菌塑料培养皿中。
3. 使用钨针切除各胚胎多余的胚外膜以及头、迷走和骶部轴向区域，分离出胚胎的躯干部分（图1）。首先，选取约9个处于HH15-17期之间的胚胎 ¹¹对于HH15及以上的发育阶段，前脑与后脑的轴线形成一个锐角，因此头部呈现向尾侧倾斜的外观。在HH17阶段，尾芽已出现并朝腹侧倾斜，但尚未形成体节。使用钨针将胚外膜修剪至距胚胎约2 mm处，并切除体节10前方的所有胚胎组织。同时，从最新形成的第五个体节左右位置开始，移除所有尾侧的胚胎组织。
4. 将分离的胚胎躯干置于 Dispase（0.24 U/ml DMEM）中，于 37 °C 孵育 1 小时 15 分钟 37° C 和 5% CO₂当主干开始孵育后，开始准备6个盖玻片（CS），用于培养NT外植体（步骤1.5–1.8）。
5. 用70%乙醇（用无菌超纯水稀释）冲洗6个CS，然后使其自然干燥。使用实验室标记笔在每个CS的中心画一个直径约1 cm的圆圈（该圆圈将用于后续识别纤维连接蛋白涂层的位置）。在每个CS的同一面上，在所画圆圈外侧标记单词“be”（或其他不对称的单词或形状），以帮助判断CS标记面朝上或朝下。
6. 将每张CS分别放入一个40 x 10 mm的无菌培养皿中，标记面朝下，将培养皿敞开放置在杀菌紫外灯下照射10分钟。
7. 应用 60 μl 纤连蛋白（FN； 10 μg/ml DMEM）加入CS的无标记表面，确保1 cm圆圈内的整个区域均被覆盖。将培养皿放入孵箱中孵育 37° C 孵育30分钟，然后小心吸除每个CS中的纤连蛋白。
8. 添加 250 μl “培养”培养基 [含L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 mcg/mL）和8%胎牛血清（FBS）的DMEM] 加入CS的FN包被区域。将含有每片CS的培养皿置于 37° C 和5% CO₂ 再次重复，直至分离出NTs。
9. 将所有孵育后的胚胎躯干转移至一个含有L15培养基的5 cm玻璃培养皿中，使用精细镊子和钨针开始分离每个神经管（NT）（图1）。用锋利的钨针沿神经管与体节的边界小心切开，注意避免损伤神经管。通常从躯干最尾端开始分离神经管更为容易。
10. 选择6条最直且最长的神经管（NTs），用于过夜培养（建议选择大约8到15个体节长度的NTs）。使用经预润的微量移液器吸头 培养 培养基中，将6个NT分别转移至各自预先准备好的CS中（步骤1.5至1.8）。确保NT不漂浮于液面。若NT漂浮，用移液枪滴加培养基直至其沉下。
11. 将每个培养皿放置于 37° C 和5% CO₂ 过夜。在将培养皿放入培养箱之前，务必确保每个NT位于其对应CS的FN包被区域内（以步骤1.5中绘制的圆圈作为参考）。如有需要，可使用微量移液器进一步调整每个NT的位置。
12. 至少加入 2 ml 的 培养 无血清培养基转移至无菌15 ml离心管中，于37°C过夜培养 37° C 和5% CO₂将瓶盖略微松开，使培养基的 pH 值过夜调整。预先孵育培养基有助于防止在培养腔内产生气泡，从而避免干扰分子梯度的形成。后续所有步骤均应使用这种“预孵育”培养基。当不使用时，该培养基应置于孵育环境中 37° C.

2. 第2天：加载改良型Zigmond小室并进行细胞迁移的延时分析

1. 从培养的6个神经嵴（NT）中，选择最适合分析的3个培养物。通常应选择至少具有一条长而直边缘的神经嵴细胞（NCC）培养物（图2A）。当天将使用这3个最佳培养物分别装载并拍摄3个改良的齐格蒙德（Zigmond）小室，每种处理条件不同。从这3个培养物中选出一个用于装载第一个小室，其余两个放回培养箱中备用。
2. 使用棉签，在一个改良的齐格蒙德小室的储液槽周围及桥接区域均匀涂抹一层薄薄的凡士林。
3. 用钨针轻轻将神经嵴（NT）从载片（CS）上分离，同时使周围的神经嵴细胞（NCCs）仍附着在载片表面。用记号笔在培养皿上标记，以记录NCC培养物最直边缘的方向。
4. 在桥接区域滴加数滴预温育的培养基。用精细镊子夹起载片（CS），将其边缘在Kimwipe纸上轻蘸，去除大部分旧的培养液，然后立即放置在改良的齐格蒙德小室上，使待拍摄的培养物直边居中对准桥接区域的长度方向，并大致垂直于桥-储液槽边界（图2A,B）。
5. 使用倒置显微镜，将NCC的直边调整至靠近将要加入疑似趋化因子的储液槽一侧的桥接区域（图2B；对照组中，对应于第二个加样储液槽）。同时，进一步微调培养物直边，使其精确垂直于桥-储液槽边界。
6. 小心但牢固地将载片（CS）压入齐格蒙德小室上的凡士林中，确保其完全密封，然后在载片边缘再涂抹额外的凡士林，以进一步保证气密性。再次微调NCC边缘的角度，以校正密封过程中可能发生的位移。
7. 首先加载不含疑似趋化因子的储液槽（图2B）。使用1 ml注射器（配有25 G × 1.5 in.针头）吸取约300 μl 预温育培养基，将培养基注入储液槽直至充满（注意避免产生气泡）。在加载下一个储液槽前，先用足量凡士林将该储液槽两侧封口。
8. 重复步骤2.7，但此次使用含有候选趋化因子的预温育培养基。在培养物上建立分子浓度梯度时，关键是要始终先加载不含待测分子的储液槽，再加载含有待测分子的储液槽。
9. 将装载完成的齐格蒙德小室置于37°C环境中孵育1小时后再开始拍摄。在约37°C条件下，以90秒为间隔，对NCC培养物最直的边缘进行连续3小时的成像（图2A,B）。在生成任何视频前，务必调整相机位置，使成像区域的边缘与最后加样储液槽相邻的桥接边界对齐并接触（图2B，上图；虚线框表示理想的成像位置）。这将有助于后续软件分析，标准化施加的分子梯度方向以及每个视频中拍摄区域与储液槽的距离。
10. 对于对照组，重复步骤2.2–2.9，分别处理在步骤2.1中选出的另外两个NCC培养物，但每个储液槽均加入适当的培养基。一种对照组中，两个储液槽均加入不含待测分子的预温育培养基；另一种对照处理中，在放置载片前，先在桥接区域加入数滴含有疑似趋化因子的预温育培养基进行预处理，然后两个储液槽均加入含该趋化因子的相同培养基。
11. 使用ImageJ（NIH）的Manual Tracking插件(rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html)和Chemotaxis and Migration Tool v1.01插件(www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html)，追踪刚成像的培养物直边周围外周NCC的迁移行为，并分析所得迁移轨迹的多个参数（图2B-C）。

3. 典型结果：

图 2D 展示了使用上述技术处理后，大量躯干神经嵴细胞对候选趋化因子产生响应的细胞轨迹示例。在此阳性响应示例中，大多数细胞表现出沿趋化因子梯度方向的净迁移运动（如红色所示）。此外，轨迹数据还可用于分析细胞迁移的其他特性。

为了直观评估改良型Zigmond小室中形成的浓度梯度，将Alexa Fluor 488标记的IgM偶联物（分子量约900 kDa）加入改良型Zigmond小室的第二个储液槽中（浓度约为40 μg/ml H₂O）。1小时后形成梯度，26小时后仍有一定残留，但在50小时时显著减弱（图3）。如果待测分子较小，则所施加的梯度降解速度将快于本实验所示结果。

图 1. 在纤连蛋白包被的盖玻片上过夜培养躯干水平神经管组织块。由于躯干神经嵴细胞（NCCs）从与第8–28体节相邻的背侧神经管脱离，因此通过显微解剖分离该段神经管，并在纤连蛋白包被的盖玻片（CS）上过夜培养，以促进NCCs从神经管组织块中迁移出来。长度介于8–15个体节之间且相对平直的分离神经管最适合过夜培养，因其通常可获得具有较长平直边界的NCC培养物。其他轴向水平神经嵴来源的神经管区域以较小字体标示。s，体节。

图2. 利用改良Zigmond小室评估移植的躯干神经嵴细胞迁移的方法。(A) 通过将神经嵴细胞（NCC）培养物中的神经管（NT）培养过夜，制备具有伸长躯干样结构的NCC培养物，并选取至少具有一条长而直边界的NCC培养物用于实验。将所选培养物中最长的直边界调整至与桥-储液槽边界垂直，从而使其与后续施加的梯度方向平行。 （B） 在精细调整NCC培养物在Zigmond小室中的位置并将盖玻片密封至小室后，即可装载小室。进行趋化性检测时，将用于盛放 不 先加入含有疑似趋化因子（-）的溶液并密封，然后向另一储液池中加入含有疑似趋化因子（+）的溶液并密封。随后，可对先前选定边界处的外周神经嵴细胞（NCCs）进行成像和追踪 手动追踪 ImageJ 的插件（底部面板）。 (C) 根据追踪数据，可评估细胞在施加梯度下的多种迁移特征。例如，可通过将细胞在x轴方向上的位移除以其迁移的总距离，来计算趋化性指数。 (D) 细胞轨迹图最初生成的一个具有吸引力的响应示例如下所示 趋化性与迁移分析工具 ImageJ 插件。每条轨迹的起始点均设为原点（0,0）。注意向趋化因子源迁移的细胞数量明显更多。所有细胞在最终位置的质心（蓝色十字；所有细胞等权重）也更接近趋化因子源。NCCs，神经嵴细胞；红色轨迹，向疑似趋化因子储液池迁移的细胞；黑色轨迹，远离迁移的细胞；（+），趋化因子浓度较高；（-），趋化因子浓度较低。

图3. 在加入 Alexa Fluor 488 IgM 偶联物后不同时间点，沿改良 Zigmond 小室桥接区域的强度分布曲线。 小室的加载方式与方案中所述相似，主要区别在于使用预孵育的水（而非 预孵育 培养基用于稀释抗体至 40 μg/ml桥的末端（远离获取上述强度分布图的切片位置）存在微小气泡。最初，桥的大部分区域未见梯度形成；1小时后梯度开始建立，并持续至26小时；到50小时时，桥的不同区域梯度的存在变得不一致，且当梯度存在时，其陡峭程度也显著降低。所有分布图均使用AxioVision 4.6软件，从桥的同一横截面（从一个桥-储液池边界到另一个）生成。需注意，即使存在气泡，梯度仍保持完整，未受干扰。高，高强度；低，低强度；x轴，桥全宽方向的距离（2 mm）；（+），装载Alexa Fluor 488 IgM偶联物的储液池；（-），储液池 不 负载偶联物。

图 4. 改良型Zigmond小室规格示意图。 图示为本研究所采用的改良型Zigmond小室及其尺寸规格（±0.2 mm）。可根据个人偏好对尺寸进行适度调整。

补充方案：改良型齐格蒙德小室的制备

请参考图4以了解以下实验方案：

1. 购买一块厚度为 3/16″ 的抛光丙烯酸板（实际厚度为 4.45 mm）。
2. 使用台式锯将板材切割成粗略尺寸为 33.25 mm × 64.57 mm 的腔室毛坯，预留 3.175 mm 的额外加工余量。
3. 将腔室毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为 6.35 mm（1/4″）的端铣刀，将腔室侧面精加工至精确尺寸：30.07 mm × 61.39 mm。
4. 将腔室毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在 x 轴和 y 轴方向的中心位置，并将该中心位置设为零点。
5. 将端铣刀轻触毛坯上表面，确定腔室高度（z 轴方向）并设为零点。
6. 使用直径为 3.91 mm（0.154″）的端铣刀，在 x 轴正方向偏移 3.03 mm 处开始加工第一个储液槽。沿 y 轴正方向切入腔室至深度 2.84 mm，移动 7.62 mm（0.300″），再反向（负方向）移动 7.62 mm（0.300″），形成总长度为 15.24 mm（0.600″）的完整储液槽。随后在 x 轴负方向偏移 3.03 mm（0.119″），重复相同步骤加工第二个储液槽。
7. 将腔室侧立，使用直径为 1.09 mm（0.043 in.）的钻头在每个储液槽末端（共 4 个）钻孔，使储液槽末端与腔室侧面连通，以便实验过程中加注培养基。
8. 将腔室在温热的肥皂水中充分浸泡，以去除可能存在的化学污染物。
9. 用去离子水充分浸泡并冲洗腔室，以去除残留的肥皂。至此，腔室已准备就绪，可按上述方法使用。

讨论

进行躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性研究已证明存在一系列挑战。躯干NCCs属于异质性干细胞群体，若进行长期培养将发生分化；因此，躯干NCCs必须通过躯干部位神经管（NT）的原代外植方法获取。传统研究均一分布细胞群体趋化反应的方法 体外 由于首先需要将细胞从躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）中分离并均匀地重铺于趋化迁移小室（例如 Boyden 小室）中，因此难以对其进行测试。 ¹²）。分离足够数量的NCCs可能十分繁琐，因为可能需要解剖数十个神经管（NTs）才能获得足够用于一次实验的、分布均一的躯干NCCs。此外，在自然生理环境中，NCCs并不会被剥离、混合并重新均匀分布。因此，为了进行某些传统趋化性实验而重新接种的NCCs，其行为可能与 体内 关于迁徙行为的条件。

本文中，我们描述了一种改进的技术，用于在更接近自然的环境中评估躯干神经嵴细胞（NCC）的趋化性。在评估分布不均的躯干NCC趋化反应时，一个主要挑战是原始外植体培养物中NCC本身具有强烈的固有极性，以及其内在的异质性身份。例如，当在培养条件下，躯干...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Omega Scientific	DM-22
青霉素-链霉素溶液	Omega Scientific	PS-20	100倍储存浓度
L-谷氨酰胺	Omega Scientific	GS-60	100倍储存浓度
胎牛血清	Omega Scientific	FB-11	批号# 105247（或性能相当的其他批次）
改良Zigmond小室	自制	N/A	储液槽体积：约 160 μl 每个；其他规格详见图4及补充制备方案
细胞培养皿	Denville	T6040	40 x 10 mm
纤连蛋白	BD	354008	10倍储存液配制方法：将1 mg FN溶于1 ml H2O 和9 ml DMEM中
盖玻片	Fisher	12-548-B	预清洁；22 x 22 mm
L15培养基	Thermo Scientific	SH30525.02
凡士林	Comforts	011110794642	100%
离心管	Biologix	10-9152	15 ml
中性蛋白酶	Cell Systems	4Z0-850	10倍储存浓度
注射器	BD	309602	1 ml
针头	BD	305127	25 G x 1.5 英寸
Alexa Fluor 488标记的IgM	Invitrogen	A21042	储存液浓度为2 mg/ml；每摩尔IgM结合7摩尔染料
解剖镊	FST	Misc.	Dumont #5 或 55；直头；不锈钢或钛材质
钨针	N/A	N/A	自制；安装于针 holder 中
钝头镊	Tiemann	160-18	用于将胚胎从蛋黄转移至林格氏液中
补充方案：改良Zigmond小室的制备
请参考图4以配合以下方案操作：
购买一张厚度为3/16"的抛光丙烯酸板（实际厚度为4.45 mm）。 使用台式锯将板材切割成略大于最终尺寸的毛坯（粗略尺寸为33.25 mm x 64.57 mm），预留3.175 mm的额外材料用于后续机加工。 将毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为6.35 mm（1/4"）的端铣刀，将小室侧面精确加工至最终尺寸：30.07 mm x 61.39 mm。 将毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在x轴和y轴方向的中心位置，并将该中心设为零点。 将端铣刀轻触毛坯顶面以确定小室高度（z轴方向），并将该位置设为高度零点。 使用直径为3.91 mm（0.154"）的端铣刀，在x轴正方向偏移3.03 mm处开始加工第一个储液槽。沿y轴正方向切入深度2.84 mm，移动7.62 mm（0.300"），然后反向（负方向）移动7.62 mm（0.300"），形成总长度为15.24 mm（0.600"）的完整储液槽。再将刀具在x轴负方向偏移3.03 mm（0.119"），重复相同过程加工第二个储液槽。 将小室侧立，使用直径为1.09 mm（0.043 英寸）的钻头在每个储液槽末端（共4个）钻孔，使孔道连接储液槽末端与小室侧面，以便实验时加入培养基。 将小室充分浸泡在温热的肥皂水中，以去除可能存在的化学污染物。 用双蒸水充分浸泡并冲洗小室，以去除残留肥皂。至此，小室已按上述方法准备就绪，可投入使用。