利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

摘要

本文介绍了一种分析移植细胞（躯干神经嵴细胞）迁移的方法。该方法成本低廉、操作温和，能够区分趋化性与化学趋向性，以及源自原代躯干神经嵴细胞培养中细胞间相互作用等其他因素对迁移极性的影响。

摘要

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物发育过程中存在的一群短暂细胞，它们在经历上皮-间质转化后从背侧神经管（NT）迁移而出^1,2。经历EMT后，NCCs沿特定路径长距离迁移，直至到达靶位点。NCCs可分化为多种细胞类型，包括神经元、胶质细胞、黑色素细胞和嗜铬细胞^1-3。NCCs能够抵达并识别其正确靶位点的能力，是所有含有躯干NCC来源组分结构正常形成的基石³。因此，阐明躯干NCC迁移的导向机制具有重要意义。已有大量分子被证实可引导NCC迁移⁴。例如，已知躯干NCC会被Semaphorin、Ephrin和Slit配体等负性导向信号排斥^5-8。然而，直到最近才鉴定出任何躯干NCC的化学趋化吸引因子⁹。

常规的 体外 研究贴壁细胞趋化行为的方法在处理永生化且分布均匀的细胞时效果最佳，但应用于某些初始分布不均且快速分化的原代干细胞培养物（如神经嵴细胞，NCCs）时则更具挑战性。一种实现躯干NCCs分布均一化以用于趋化研究的方法是：从原代神经管（NT）外植体培养物中分离躯干NCCs，随后消化并重新接种，使其达到近100%汇合。然而，这种接种方法需要耗费大量时间和精力以获取足够的外植体细胞，操作过程较为剧烈，且导致躯干NCCs的分布方式与体内自然分布状态存在差异。 体内 条件。

本文报道了一种体外方法，能够在无需均一细胞分布的情况下评估躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性及其他迁移反应。该技术利用改良的Zigmond小室对原代、未受干扰的躯干NCCs进行延时成像（标准Zigmond小室的描述见其他文献¹⁰）。通过在培养物边缘的躯干NCCs暴露于与其预测自然迁移方向垂直的趋化因子梯度，可检测施加的趋化因子梯度所诱导的迁移极性改变。该方法成本低廉，每次重复处理仅需培养两个神经管（NT）外植体，避免了剧烈的细胞解离操作（如胰酶消化），使躯干NCCs保持更接近体内状态的分布，缩短了外植与实验之间的时间间隔（可能降低分化风险），并允许对多种迁移特征进行延时评估。

方案

1. 第1天：分离躯干神经管并接种于盖玻片进行过夜培养

1. 将鸡胚蛋在38℃下孵育56小时° C. 从培养箱中取出卵，用70%乙醇轻微喷洒，然后使其干燥。将卵打开放入经紫外灭菌的玻璃托盘中。
2. 用弯头剪刀在血岛周围剪开，然后用钝头镊子夹住胚外膜将每个胚胎从卵黄中取出，并置于鸡林格氏液中。将胚胎放入盛有鸡林格氏液的无菌塑料培养皿中。′溶液
3. 使用钨针修剪掉每个胚胎多余的胚外膜以及颅部、迷走神经和骶部的轴向组织，分离出胚胎的躯干部分（图1）。首先，选取约9个处于HH15-17期之间的胚胎 ¹¹对于HH15期及以后阶段，前脑与后脑的轴线形成一个锐角，因此头部呈现向尾侧倾斜的外观。在HH17期，尾芽已出现并朝腹侧倾斜，但尚未形成体节。使用钨针将胚外膜修剪至距胚胎约2 mm处，并切除第10体节前方的所有胚胎组织。同时，从最新形成的第5个体节左右开始，去除所有尾侧的胚胎组织。
4. 将分离的胚胎躯干置于 Dispase（0.24 U/ml DMEM）中，在 37℃ 下孵育 1 小时 15 分钟° C 和 5% CO₂一旦躯干开始孵育，即开始准备6个盖玻片（CS），用于培养NT外植体（步骤1.5–1.8）。
5. 将6个CS用70%乙醇（用无菌超纯水稀释）冲洗，然后使其干燥。使用实验室标记笔在每个CS的中心画一个直径约1 cm的圆圈（该圆圈将用于后续识别纤维连接蛋白涂层的位置）。在同一面的每个CS上，在所画圆圈外侧写上“be”（或其他不对称的单词或形状）（这有助于判断CS的标记面是朝上还是朝下）。
6. 将每张CS置于单独的40 x 10 mm无菌培养皿中，标记面朝下，将培养皿敞开放置在杀菌紫外灯下照射10分钟。
7. 加入60 μl 纤连蛋白（FN；10 μg/ml DMEM) 涂覆于CS的未标记表面，确保1 cm圆圈内的整个区域均被覆盖。将培养皿置于37℃孵育。° 在37°C下孵育30分钟，然后小心地从每个CS中吸除纤连蛋白。
8. 加入250 μl 在CS的FN包被区域加入“培养”培养基[含L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 mcg/ml）和8%胎牛血清（FBS）的DMEM]。将含有每片CS的培养皿置于37° C 和 5% CO₂₂ 再次重复，直到分离出NTs。
9. 将所有孵育后的胚胎躯干转移至一个含有L15培养基的5 cm玻璃培养皿中，使用精细镊子和钨针开始分离每个神经管（NT）（图1）。用锋利的钨针沿神经管与体节的边界小心切开，注意避免损伤神经管。通常从躯干最尾端开始分离神经管更为容易。
10. 选择6条最直且最长的神经管（NT）进行过夜培养（建议选择约8至15个体节长度的神经管）。使用经预润洗的微量移液器吸头 培养 培养基中，将6个NT分别转移至各自预先准备好的CS中（步骤1.5至1.8）。确保NT不漂浮于液面。若NT漂浮，用移液枪滴加培养基直至其沉下。
11. 将每个培养皿置于37° C 和 5% CO₂₂ 过夜。在将培养皿放入培养箱之前，务必确保每个NT位于其对应CS的FN包被区域内（以步骤1.5中绘制的圆圈作为参考）。如有需要，可使用微量移液器进一步调整每个NT的位置。
12. 至少加入 2 ml 的 培养 将无血清培养基加入无菌15 ml离心管中，37℃孵育过夜° C 和 5% CO₂将瓶盖略微松开，使培养基的pH值过夜调整。预先孵育培养基有助于防止在培养腔内产生气泡，从而避免干扰分子梯度的形成。后续所有步骤均应使用这种“预孵育”的培养基。当不使用时，该培养基应在37℃继续孵育。° C.

2. 第2天：加载改良的Zigmond小室并进行细胞迁移的延时分析

1. 在培养的6个神经管（NT）中，选出最适合分析的3个培养样本。通常应选择具有至少一条长而直边缘的神经嵴细胞（NCC）培养样本（图2A）。这3个最佳培养样本将用于在当天不同时间装载并拍摄3个改良的齐格蒙德小室（Zigmond chamber），每个小室采用不同的处理条件。从这3个培养样本中，选取其中一个用于装载第一个小室，其余样本放回培养箱中以备后续使用。
2. 使用棉签在改良的Zigmond小室的储液槽和桥接区域周围均匀涂抹一层薄薄的凡士林。
3. 用钨针轻轻将神经管（NT）从体节（CS）上分离，同时使周围的神经嵴细胞（NCCs）仍附着在体节表面。用笔在培养皿上标记，以记录神经嵴细胞培养物最平直边缘的方位。
4. 滴加几滴 预孵育 将培养基转移至桥上。用精细镊子夹起CS，用Kimwipe轻拭CS边缘以去除大部分旧培养基 培养 培养基，然后立即将细胞样品置于改良的Zigmond小室上，使待拍摄的培养区域的直边居中对准桥的长度方向，并大致垂直于桥与储液池的边界（图2A、B）。
5. 使用倒置显微镜，将神经嵴细胞（NCC）培养物的直线边界移至靠近将盛放疑似趋化因子的储液池一侧的桥接区域边缘（图2B；对照组中，对应于第二个加样储液池的一侧）。同时，进一步精细调整培养物的直线边缘，使其与桥接区域和储液池之间的边界垂直。
6. 小心但牢固地将CS压入Zigmond小室中已有的凡士林中，确保其完全密封在小室上，然后在CS边缘再添加额外的凡士林，以进一步确保密封性。再次微调NCC边界的倾斜角度，以校正密封过程中可能发生的任何位移。
7. 加载将要使用的储液槽 不 首先加入疑似趋化因子（图2B）。使用1 ml注射器（配有25 G × 1.5 in.针头），吸入约300 μl 预孵育 培养基并将其注入储液槽直至充满（注意避免在储液槽中产生气泡）。在装载下一个储液槽之前，用足量的凡士林将储液槽两端封住。
8. 重复步骤 2.7，但此次使用 预孵育 含有候选趋化因子的培养基。在建立跨培养体系的分子浓度梯度时，必须始终将待测分子加入储液池中 之后 加载不含待测分子的储液槽。
9. 将装有样品的Zigmond小室置于37° C，孵育1小时后开始拍摄。在约37℃继续孵育条件下，以90秒为间隔，对神经嵴细胞（NCC）培养物中最平直的边缘区域进行连续3小时成像。° C（图2A、B）。在制作任何视频之前，务必调整相机位置，使所获取图像的边缘与最后一个加样储液池边缘相接并对其（图2B，上图；虚线框表示理想的成像位置）。这将有助于标准化每个视频中施加的分子梯度方向以及成像储液池与成像区域之间的距离，从而便于后续的软件分析。
10. 作为对照，在步骤 2.1 中选择的另外两种 NCC 培养物中分别重复步骤 2.2–2.9，但向每个储液槽中加入相应的培养基。对于一种对照类型，将两个储液槽均加入 预孵育 不含待测分子的培养基。作为第二种对照处理，用少量待测物滴加润洗桥梁 预孵育 在安装CS之前，先将含有疑似趋化因子的培养基加入其中。然后，将相同的含有疑似趋化因子的培养基加入两个储液池中。
11. 使用 ImageJ（NIH） 手动追踪 （rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html） 和 趋化与迁移分析工具 v1.01 (www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html) 使用插件追踪刚成像培养区域边缘处外周神经嵴细胞（NCCs）的迁移，并分析所获得迁移轨迹的多种参数（图2B-C）。

3. 代表性结果：

图2D展示了一个使用上述技术检测到大量躯干神经嵴细胞对候选趋化因子产生响应的影片中的细胞运动轨迹示例。在此阳性响应示例中，大多数细胞表现出沿趋化因子浓度梯度方向的净移动（如红色所示）。轨迹数据也可用于分析细胞迁移的其他特性。

为了直观评估改良型Zigmond小室中形成的浓度梯度，将Alexa Fluor 488标记的IgM偶联物（分子量约900 kDa）加入改良型Zigmond小室的第二个储液槽中（浓度约为40 μg/ml H₂O）。1小时后形成梯度，26小时后仍可检测到一定程度的梯度，但在50小时时显著减弱（图3）。如果待测分子更小，则所施加的梯度衰减速率将快于本实验所示结果。

图1. 神经管 trunk 节段的分离及在纤连蛋白包被的盖玻片上过夜培养。由于 trunk 节段的神经嵴细胞（NCCs）从毗邻第8–28体节的背侧神经管（NT）脱离，因此通过显微解剖分离该段神经管，并在纤连蛋白包被的盖玻片（CS）上过夜培养，以促进NCCs从神经管外植体迁移出来。长度介于8–15个体节之间且形态较平直的分离神经管最适合过夜培养，因其通常可获得具有较长平直边界的NCC培养物。其他轴向水平神经嵴来源的神经管区域以较小字体标示。s，体节。

图2. 利用改良Zigmond小室评估移植的躯干神经嵴细胞迁移的方法。（A） 通过将神经管（NT）进行过夜培养，并将由此获得的神经嵴细胞（NCC）培养物中至少具有一条长而直边界的样本用于后续实验。选取的培养物将其最长的直边界与桥-储液槽边界垂直放置，从而与后续施加的梯度方向平行。 （B） 在精细调整NCC培养物在Zigmond小室中的位置并将盖玻片密封至小室后，即可加载小室。进行趋化性测试时，将用于盛放 不 首先加载含有疑似趋化因子（-）的储液池并密封，然后加载含有疑似趋化因子（+）的另一储液池并密封。随后可对先前选定边界处的外周神经嵴细胞（NCCs）进行成像和追踪 手动追踪 ImageJ 插件（底部面板）。 (C) 根据追踪数据，可评估细胞在施加梯度下的多种迁移特征。例如，可通过将细胞在x轴方向上的位移除以其迁移的总距离，来计算趋化性指数。 (D) 细胞轨迹图最初生成的一个具有吸引力的响应示例如下所示 趋化性与迁移分析工具 ImageJ 插件。每条轨迹的起始点均设为原点（0,0）。注意向趋化因子源迁移的细胞数量明显更多。所有细胞在最终位置的质心（蓝色十字；所有细胞等权重）也更接近趋化因子源。NCCs，神经嵴细胞；红色轨迹，向疑似趋化因子储存区迁移的细胞；黑色轨迹，远离迁移的细胞；（+），趋化因子浓度较高；（-），趋化因子浓度较低。

图3. 在加入Alexa Fluor 488 IgM偶联物后不同时间点，沿改良Zigmond小室桥接区域的强度分布曲线。 小室的加载方式与方案中所述相似，主要区别在于使用预孵育的水（而非 预孵育 中）用于将抗体稀释至40 μg/ml，在桥的末端（远离获取上述强度谱的切片位置）存在小的气泡。最初，桥的大部分区域没有梯度；1小时后梯度形成，并持续至26小时；到50小时时，桥的不同区域梯度的存在变得不一致，且当梯度存在时，其陡度显著降低。所有谱图均使用AxioVision 4.6软件从桥的同一横截面（从一个桥-储液池边界到另一个）生成。需注意，即使存在气泡，梯度也未被破坏。High，高强度；Low，低强度；x轴，跨越整个桥宽的距离（2 mm）；(+)，加载Alexa Fluor 488 IgM偶联物的储液池；(-)，储液池 不 负载偶联物。

图4. 改良Zigmond小室的规格。 图示为本实验所用的改良Zigmond小室及其尺寸规格（±0.2 mm）。可根据个人偏好适度调整测量参数。

补充方案：改良型齐格蒙德小室的制备

请参考图4以了解以下实验方案：

1. 购买一块厚度为 3/16″ 的抛光丙烯酸板（实际厚度为 4.45 mm）。
2. 使用台锯将腔室毛坯切割成略大于粗略尺寸 33.25 mm × 64.57 mm 的尺寸，以预留 3.175 mm 的额外材料用于后续加工。
3. 将腔室毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为 6.35 mm（1/4″）的端铣刀，将腔室侧面精加工至精确尺寸：30.07 mm × 61.39 mm。
4. 将腔室毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在 x 轴和 y 轴方向的中心位置，并将该中心位置设为零点。
5. 将端铣刀轻触毛坯顶面，确定腔室高度（z 轴）位置，并将高度归零。
6. 使用直径为 3.91 mm（0.154″）的端铣刀，沿 x 轴正方向偏移 3.03 mm 开始加工第一个储液槽。沿 y 轴正方向切入深度为 2.84 mm，移动 7.62 mm（0.300″），然后反向（负方向）移动 7.62 mm（0.300″），形成总长度为 15.24 mm（0.600″）的完整储液槽。再沿 x 轴负方向偏移 3.03 mm（0.119″），重复相同步骤加工第二个储液槽。
7. 将腔室侧立，使用直径为 1.09 mm（0.043 in.）的钻头在每个储液槽末端（共 4 个）钻孔，使储液槽末端与腔室侧面连通，以便实验过程中加入培养基。
8. 将腔室浸泡在温热的肥皂水中，以去除可能存在的化学污染物。
9. 用双蒸水充分浸泡并冲洗腔室，以去除残留的肥皂。至此，腔室已准备就绪，可按上述方法使用。

讨论

进行躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性研究已证明存在一系列挑战。躯干NCCs属于异质性干细胞群体，若进行长期培养将发生分化；因此，躯干NCCs必须通过躯干部位神经管（NT）的原代外植方法获取。传统研究均一分布细胞群体趋化反应的方法 体外 由于首先需要将细胞从躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）中分离并均匀地重铺于趋化迁移小室（例如 Boyden 小室）中，因此难以对其进行测试。 ¹²）。分离足够数量的NCCs可能十分繁琐，因为可能需要解剖数十个神经管（NTs）才能获得足够用于一次实验的、分布均一的躯干NCCs。此外，在自然生理环境中，NCCs并不会被剥离、混合并重新均匀分布。因此，为了进行某些传统趋化性实验而重新接种的NCCs，其行为可能与 体内 关于迁徙行为的条件。

本文中，我们描述了一种改进的技术，用于在更接近自然的环境中评估躯干神经嵴细胞（NCC）的趋化性。在评估分布不均的躯干NCC趋化反应时，一个主要挑战是原始外植体培养物中NCC本身具有强烈的固有极性，以及其内在的异质性身份。例如，当在培养条件下，躯干...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Omega Scientific	DM-22
青霉素-链霉素溶液	Omega Scientific	PS-20	100倍储存浓度
L-谷氨酰胺	Omega Scientific	GS-60	100倍储存浓度
胎牛血清	Omega Scientific	FB-11	批号# 105247（或性能相当的其他批次）
改良Zigmond小室	自制	N/A	储液槽体积：约 160 μl 每个；其他规格详见图4及补充制备方案
细胞培养皿	Denville	T6040	40 x 10 mm
纤连蛋白	BD	354008	10倍储存液配制方法：将1 mg FN溶于1 ml H2O 和9 ml DMEM中
盖玻片	Fisher	12-548-B	预清洁；22 x 22 mm
L15培养基	Thermo Scientific	SH30525.02
凡士林	Comforts	011110794642	100%
离心管	Biologix	10-9152	15 ml
中性蛋白酶	Cell Systems	4Z0-850	10倍储存浓度
注射器	BD	309602	1 ml
针头	BD	305127	25 G x 1.5 英寸
Alexa Fluor 488标记的IgM	Invitrogen	A21042	储存液浓度为2 mg/ml；每摩尔IgM结合7摩尔染料
解剖镊	FST	Misc.	Dumont #5 或 55；直头；不锈钢或钛材质
钨针	N/A	N/A	自制；安装于针 holder 中
钝头镊	Tiemann	160-18	用于将胚胎从蛋黄转移至林格氏液中
补充方案：改良Zigmond小室的制备
请参考图4以配合以下方案操作：
购买一张厚度为3/16"的抛光丙烯酸板（实际厚度为4.45 mm）。 使用台式锯将板材切割成略大于最终尺寸的毛坯（粗略尺寸为33.25 mm x 64.57 mm），预留3.175 mm的额外材料用于后续机加工。 将毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为6.35 mm（1/4"）的端铣刀，将小室侧面精确加工至最终尺寸：30.07 mm x 61.39 mm。 将毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在x轴和y轴方向的中心位置，并将该中心设为零点。 将端铣刀轻触毛坯顶面以确定小室高度（z轴方向），并将该位置设为高度零点。 使用直径为3.91 mm（0.154"）的端铣刀，在x轴正方向偏移3.03 mm处开始加工第一个储液槽。沿y轴正方向切入深度2.84 mm，移动7.62 mm（0.300"），然后反向（负方向）移动7.62 mm（0.300"），形成总长度为15.24 mm（0.600"）的完整储液槽。再将刀具在x轴负方向偏移3.03 mm（0.119"），重复相同过程加工第二个储液槽。 将小室侧立，使用直径为1.09 mm（0.043 英寸）的钻头在每个储液槽末端（共4个）钻孔，使孔道连接储液槽末端与小室侧面，以便实验时加入培养基。 将小室充分浸泡在温热的肥皂水中，以去除可能存在的化学污染物。 用双蒸水充分浸泡并冲洗小室，以去除残留肥皂。至此，小室已按上述方法准备就绪，可投入使用。