我们介绍一种结核分枝杆菌计数的替代方法 体外，该方法采用报告基因标记的分枝杆菌替代菌落形成单位（CFU）进行检测。可同时测定病原体的“存活”情况及宿主反应标志物，为结核病背景下宿主/病原体相互作用的研究提供一种低成本、多功能且具有功能性的系统。
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方法文章
一种功能性全血检测法，用于测定分枝杆菌的存活能力，使用报告基因标记的卡介苗或结核分枝杆菌（BCG lux/M.Tb lux）
本文内容
摘要
摘要
功能检测在评估特定疫苗免疫原性的测量中长期发挥着关键作用。这种检测通常以血清杀菌滴度来表示。针对儿童疫苗所引发的血清杀菌滴度研究，已使我们能够建立并验证保护性免疫反应的临界值，这些临界值目前已被常规使用。然而，对于主要诱导效应T细胞应答等细胞介导免疫的疫苗（例如结核病疫苗），尚无类似检测被推进至常规评估中。在动物模型中，候选疫苗的性能通常通过标准化的杀菌检测进行常规评估，目前所有新型结核病疫苗候选物在进入Ⅰ期人体试验前均须经过此评估步骤。理想情况下，新型抗结核疫苗的免疫原性及其产生保护效果的可能性，现在也应在人体模型中经历类似的分步评估，包括在杀菌检测中的测定。
在结核病疫苗研究中，杀菌实验在动物模型中已有成熟应用，用于筛选潜在的有前景疫苗候选物。不同器官中细菌载量的减少是衡量免疫原性的主要读数指标。然而，迄今为止，此类实验尚未纳入新型抗结核疫苗的临床试验中。
尽管关于人类巨噬细胞内杀灭分枝杆菌的确切机制仍存在不确定性，但巨噬细胞与T细胞和分枝杆菌之间的相互作用显然是必需的。本文所述的杀菌试验代表了一种新型的杀菌检测方法，可在全血中所有其他细胞和体液因子共存的情况下研究这些关键的细胞组分，而无需对其各自相对贡献进行假设。我们课题组所描述的该检测方法仅需少量全血，已成功应用于结核病流行地区成人和儿童的研究。我们已证实卡介苗（BCG疫苗）的免疫原性、HIV阳性患者中分枝杆菌生长增加，以及抗逆转录病毒治疗和维生素D对分枝杆菌存活的影响。 体外在此，我们总结了该方法，并利用这一相对简单、低成本且适合野外使用的模型展示了可重复性数据。
注意：定义/缩写
BCG lux = M. bovis BCG，蒙特利尔株，经含有来自Vibrio harveyi的luxAB基因的穿梭质粒pSMT1转化，该基因受分枝杆菌GroEL（hsp60）启动子调控。
CFU = 菌落形成单位（用于衡量分枝杆菌存活能力的指标）。
方案
1. BCG lux 报告菌株的制备
- 在含有0.2%甘油、0.05%吐温80和10% ADC增补剂的Middlebrook 7H9液体培养基中，将BCG lux（经穿梭质粒pSMT1转化的M. bovis BCG Montreal株）于200 rpm振荡培养至对数中期。
- 在发光仪专用管中，用无菌PBS将BCG lux菌液做1:10稀释（900 μl PBS + 100 μl BCG lux菌液），每组设两个重复。
- 将装有N-癸醛（荧光素酶底物）的管子安装至仪器后部，并确保盖子已固定，且所有管子放置到位。
- 通过“引物程序”对发光仪的注射器进行底物预冲洗，设置为向置于发光仪中的3个空引物管各注射100 μl，共3次。
- 将上述2个样品管放入发光仪中，运行程序，向每管注射100 μl底物，并以1秒为间隔连续读数20秒。
- 当菌液的发光强度达到1×108 RLU/ml至2×108 RLU/ml时（通常需要约3–4天培养），向50 ml Falcon管中的菌液加入等体积无菌30%甘油，轻轻混匀。
- 将混合液分装至已标记的2 ml螺口微量离心管中，每管1.5 ml，于-80°C保存。
2. 确定储备液 RLU/CFU 相关性及分装样品的含量
- 在200 ml带通气盖的锥形瓶中加入15 ml含10% ADC添加剂的Middlebrook 7H9培养基。
- 加入15 μl潮霉素和30 μl 20%吐温。
- 从冰箱中取出一管BCG lux，在生物安全柜中室温（RT）解冻。将管内内容物加入培养基中，并拧紧瓶盖。
- 在37°C、200 rpm振荡条件下培养4天。
- 每天制备系列10倍稀释液（1:10、1:100、1:1000、1:10,000和1:100,000），用于菌落形成单位（CFU）测定。
- 平行设置相同稀释度并做复孔，用于检测发光强度（参见第1.2–1.6部分）。
- 准备两块三区Middlebrook 7H11琼脂平板（每升液体培养基含0.5%甘油、10% OADC添加剂、1 ml 20%吐温和1 ml潮霉素）。
- 使用不同的涂布棒，将每种稀释液各取100 μl分别接种到每块平板的不同区域，均匀涂布于各小室表面。
- 用Parafilm封膜密封每块平板，放入无菌塑料袋中，再用高压灭菌指示胶带密封，倒置平板于37°C培养2周。
- 定期观察，直至菌落形成单位（CFU）出现（2–3周）。
- 计数时，将平板从培养箱中取出，置于菌落计数器上。根据复孔平板计算每个稀释度的平均值。
- 利用各稀释度对应的RLU和CFU数值计算RLU/CFU比值，该比值应在3–5 RLU/CFU之间。
3. 准备用于全血接种的 BCG lux 培养物
- 在安全柜中，向带有通气盖的 200 ml 锥形瓶中加入 15 ml 含 10% ADC 添加剂的 Middlebrook 7H9 培养基。
- 加入 15 μl 潮霉素和 30 μl 20% 吐温。
- 从冰箱中取出一管 BCG lux，在安全柜中室温解冻。将冻存管中的内容物加入培养基中，并拧紧瓶盖。
- 在 37°C、200 rpm 振荡条件下培养 2 至 4 天。
- 在发光仪检测管中，用无菌 PBS 将 BCG lux 培养物稀释 10 倍（900 μl PBS + 100 μl BCG lux 培养物），每个样本设两个重复。
- 用底物启动发光仪（如上所述），轻轻涡旋混匀两根检测管，然后放入发光仪中读数（如上所述）。
- 根据此读数，用 PBS 将培养物稀释至相当于 7×106 RLU 的水平（假设每毫升血液中含有约 2×105 至 4×105 个单核细胞，则可获得约 2×105 CFU/ml 血液的接种量，BCG 与单核细胞的比例约为 1:1）。
4. 全血的制备
- 取3至5ml静脉血，加入含有不含防腐剂的肝素的试管中。
- 将血液转移至50ml Falcon管中，并用等体积含谷氨酰胺和25mM HEPES的RPMI 1640培养基稀释（不加青霉素/链霉素）。
- 为每个时间点（共6管：0小时3管，96小时3管；如有需要，可为额外时间点设置更多试管）将稀释后的血液各900μl分装至无菌bijou管中，每组设三个重复。
- 将Middlebrooks 7H9培养基（含10% ADC补充剂 + 50μg/ml潮霉素，即用于培养BCG lux的相同培养基）各900μl分装至2个重复的试管中作为生长对照组。
- 向每管血液以及2个生长对照管中各加入100μl稀释后的BCG lux菌液。
- 充分混匀，将用于96小时时间点的3个bijou管及2个生长对照管平放于37°C摇床中培养，摇床转速设为20转/分钟（无需CO2环境）。
5. 测量发光（0 小时和 96 小时）
- 将3个离心管在2000g下离心10分钟。
- 小心移除300μl上清液，避免扰动沉淀，转移至2ml带螺帽的微量离心管中，并于-80°C冷冻，用于后续细胞因子分析。
- 向每个离心管中加入300μl PBS，以补充移除的上清液体积。
- 将每个离心管中的内容物吸出并转移至相应的50ml Falcon管中，每管加入8ml蒸馏水。启动计时器，孵育10分钟。
注意：此步骤对时间敏感，从细胞首次接触水开始计算，孵育时间不得超过10分钟。 - 用2ml蒸馏水冲洗每个离心管，涡旋5秒，然后倒入相应的Falcon管中。
- 10分钟孵育结束后，将Falcon管在2000g下离心10分钟。
- 将上清液倾倒至Surfanios消毒液中。
- 向每份沉淀中加入数颗玻璃珠，涡旋混匀。
- 向每管中加入1ml无菌PBS，涡旋混匀。
- 在发光仪检测管中，用PBS对每个样本（包括96小时时间点）进行1:10稀释，每个样本设两个复孔（900μl PBS + 100μl样本）。对每个生长对照组也进行相同的稀释。
- 轻轻涡旋混匀检测管，放入发光仪中读取数值（操作如前所述）。
注意：同一样本的三个复孔读数之间差异应不超过15%。
6. 典型结果：
进行全血lux检测时，必须使用处于对数生长期的细菌，即接种样本前需培养48-72小时，因为刚从冷冻保存中取出或处于稳定期的细菌其代谢活性均不理想。为避免实验结果的变异性，同一系列实验的预培养时间应统一为48小时或72小时。图1显示了卡介苗（BCG）lux菌株的典型生长曲线。其倍增时间约为24小时，直至进入稳定期。
图 1. BCG lux 在 7H9 培养基中 96 小时内的代表性生长曲线，以及 RLU 与 CFU 的相关性。
尽管相对发光单位（RLU）值始终与菌落形成单位（CFU）相关，但每个CFU对应的RLU数量可能因菌种批次不同而有所变化，因此建议在一系列实验中使用同一支冻存菌种，以确保感染复数（MOI）的一致性。
表1显示了接种时（T0）和96小时后的原始数据示例。生长倍数通过公式T96/T0计算得出，但当然也可以测量其他时间间隔的数据。然而，不建议将培养物使用超过96小时，因为此时会出现明显的细胞死亡。
表 1. 3 名成年供体在接种时（T0）和 96 小时后（T96）的原始数据示例，以及计算得到的生长倍数。
根据个体体内已有的抗原特异性记忆免疫应答情况以及可能的中性粒细胞计数，生长比率在不同个体间存在差异，如图2所示，在有无HIV感染的儿童血液中可观察到这种差异。通常情况下，幼儿的生长比率高于成人，结核菌素皮肤试验（TST）阳性个体的生长比率低于TST阴性个体，而HIV感染者由于CD4 T细胞数量减少——该细胞是针对分枝杆菌细胞免疫应答的关键介质之一——表现出较高的生长比率。
图2. 不同供体间的变异性：根据患者基础HIV状态，T0与96小时的细胞生长比率比较。
图3展示了在一段时间内生长比率的可重复性，总结了64名供体在12个月内两次采血以及单名供体为对照实验进行多次采血的结果。可能引起变异性的原因包括分枝杆菌致敏状态的变化或宿主细胞因子水平的波动，这在许多生物测定中均有观察到。
图 3. (a) 单一供体在 12 个月内 12 次检测结果。(b) 64 名不同供体在 12 个月内两次检测结果。
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讨论
在结核病疫苗研究中，杀菌实验已在动物模型中得到广泛应用，用于筛选具有潜在前景的候选疫苗。不同器官中细菌载量的减少是评估免疫原性的主要读出指标。
第一代人类杀菌试验仅使用感染了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的巨噬细胞进行设计。以菌落形成单位（CFU）作为分枝杆菌存活情况的主要检测指标，检测时间至少为3周。这些试验依赖于外周血单个核细胞（PBMC）的制备、贴壁单核细胞/巨噬细胞的培养，以及在特定时间点进行细胞裂解1,2。
随着人们对巨噬细胞与T细胞之间更复杂的相互作用以控制M. tuberculosis的认识不断深入，以及利用磁珠分离不同细胞群体的技术成为可能，这些实验体系已得到改进，即在检测中重新加入T细胞并测定CFU3,4,5。部分此类检测使用了活的M. tuberculosis，但杀菌实验中研究M. tuberculosis的主要障碍之一是需要生物安全 containment 设施，且菌落形成单...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由惠康基金会（Wellcome Trust）向 Beate Kampmann 提供的个人研究员资助（056608，GRO77273）资助完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCG lux | 多种 | n/a | |
| Middlebrook 7H11 琼脂 | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 液体培养基 | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC 增菌液 | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC 补充剂 | BD Biosciences | 212240 | |
| 吐温-80 (Tween 80) | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| 甘油 (Glycerol) | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| 潮霉素 B (Hygromycin B) | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| 正癸醛 (N-decyl aldehyde) | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| 乙醇 (Ethanol)（>99.7%） | VWR international | 101077 | |
| 无菌 PBS | 本实验室制备 | n/a | |
| RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺，25 mM HEPES） | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| 无菌蒸馏水 | 本实验室制备 | n/a | |
| 带注射口的试管式发光检测仪（注射口为必需） | Berthold Technologies | ||
| 发光检测用试管，12 × 75 mm，耐热玻璃无边口 | Corning | 99445-12 | |
| 带通气盖的锥形瓶，无菌聚碳酸酯，250 ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer 血液采集管（不含防腐剂的肝素） | BD Biosciences | 367676 | |
| 50 ml 圆锥形离心管（Falcon 管） | BD Biosciences | 352077 | |
| 7 ml Sterilin 聚丙烯标本小管（bijou 管） | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin 通用容器（30 ml） | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| 玻璃珠，直径 2 mm | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10 ml 移液管及移液器 | 任意供应商 | ||
| 1000μl 和 200μl 移液器及滤芯吸头 | 任意供应商 | ||
| II 级生物安全柜 | |||
| 冰箱（4°C） | |||
| 离心机 | |||
| 摇床平台（1800），用于混匀试管 | |||
| 轨道摇床培养箱，设定为 37°C，用于细菌培养物的扩增 |
参考文献
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
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