一种功能性全血检测法，用于测定分枝杆菌的存活能力，使用报告基因标记的卡介苗或结核分枝杆菌（BCG lux/M.Tb lux）

摘要

我们介绍一种结核分枝杆菌计数的替代方法 体外，该方法采用报告基因标记的分枝杆菌替代菌落形成单位（CFU）进行检测。可同时测定病原体的“存活”情况及宿主反应标志物，为结核病背景下宿主/病原体相互作用的研究提供一种低成本、多功能且具有功能性的系统。

摘要

功能检测在评估特定疫苗免疫原性的测量中长期发挥着关键作用。这种检测通常以血清杀菌滴度来表示。针对儿童疫苗所引发的血清杀菌滴度研究，已使我们能够建立并验证保护性免疫反应的临界值，这些临界值目前已被常规使用。然而，对于主要诱导效应T细胞应答等细胞介导免疫的疫苗（例如结核病疫苗），尚无类似检测被推进至常规评估中。在动物模型中，候选疫苗的性能通常通过标准化的杀菌检测进行常规评估，目前所有新型结核病疫苗候选物在进入Ⅰ期人体试验前均须经过此评估步骤。理想情况下，新型抗结核疫苗的免疫原性及其产生保护效果的可能性，现在也应在人体模型中经历类似的分步评估，包括在杀菌检测中的测定。

在结核病疫苗研究中，杀菌实验在动物模型中已有成熟应用，用于筛选潜在的有前景疫苗候选物。不同器官中细菌载量的减少是衡量免疫原性的主要读数指标。然而，迄今为止，此类实验尚未纳入新型抗结核疫苗的临床试验中。

尽管关于人类巨噬细胞内杀灭分枝杆菌的确切机制仍存在不确定性，但巨噬细胞与T细胞和分枝杆菌之间的相互作用显然是必需的。本文所述的杀菌试验代表了一种新型的杀菌检测方法，可在全血中所有其他细胞和体液因子共存的情况下研究这些关键的细胞组分，而无需对其各自相对贡献进行假设。我们课题组所描述的该检测方法仅需少量全血，已成功应用于结核病流行地区成人和儿童的研究。我们已证实卡介苗（BCG疫苗）的免疫原性、HIV阳性患者中分枝杆菌生长增加，以及抗逆转录病毒治疗和维生素D对分枝杆菌存活的影响。 体外在此，我们总结了该方法，并利用这一相对简单、低成本且适合野外使用的模型展示了可重复性数据。

注意：定义/缩写

BCG lux = M. bovis BCG，蒙特利尔株，经含有来自Vibrio harveyi的luxAB基因的穿梭质粒pSMT1转化，该基因受分枝杆菌GroEL（hsp60）启动子调控。
CFU = 菌落形成单位（用于衡量分枝杆菌存活能力的指标）。

方案

1. BCG lux 报告菌株的制备

1. 在含有0.2%甘油、0.05%吐温80和10% ADC增补剂的Middlebrook 7H9液体培养基中，将BCG lux（经穿梭质粒pSMT1转化的M. bovis BCG Montreal株）于200 rpm振荡培养至对数中期。
2. 在发光仪专用管中，用无菌PBS将BCG lux菌液做1:10稀释（900 μl PBS + 100 μl BCG lux菌液），每组设两个重复。
3. 将装有N-癸醛（荧光素酶底物）的管子安装至仪器后部，并确保盖子已固定，且所有管子放置到位。
4. 通过“引物程序”对发光仪的注射器进行底物预冲洗，设置为向置于发光仪中的3个空引物管各注射100 μl，共3次。
5. 将上述2个样品管放入发光仪中，运行程序，向每管注射100 μl底物，并以1秒为间隔连续读数20秒。
6. 当菌液的发光强度达到1×10⁸ RLU/ml至2×10⁸ RLU/ml时（通常需要约3–4天培养），向50 ml Falcon管中的菌液加入等体积无菌30%甘油，轻轻混匀。
7. 将混合液分装至已标记的2 ml螺口微量离心管中，每管1.5 ml，于-80°C保存。

2. 确定储备液 RLU/....

讨论

在结核病疫苗研究中，杀菌实验已在动物模型中得到广泛应用，用于筛选具有潜在前景的候选疫苗。不同器官中细菌载量的减少是评估免疫原性的主要读出指标。

第一代人类杀菌试验仅使用感染了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的巨噬细胞进行设计。以菌落形成单位（CFU）作为分枝杆菌存活情况的主要检测指标，检测时间至少为3周。这些试验依赖于外周血单个核细胞（PBMC）的制备、贴壁单核细胞/巨噬细胞的培养，以及在特定时间点进行细胞裂解^1,2。

随着人们对巨噬细胞与T细胞之间更复杂的相互作用以控制M. tuberculosis的认识不断深入，以及利用磁珠分离不同细胞群体的技术成为可能，这些实验体系已得到改进，即在检测中重新加入T细胞并测定CFU^3,4,5。部分此类检测使用了活的M. tuberculosis，但杀菌实验中研究M. tuberculosis的主要障碍之一是需要生物安全 containment 设施，且菌落形成单.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCG lux	多种	n/a
Middlebrook 7H11 琼脂	BD Biosciences	283810
Middlebrook 7H9 液体培养基	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC 增菌液	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC 补充剂	BD Biosciences	212240
吐温-80 (Tween 80)	Sigma-Aldrich	274364
甘油 (Glycerol)	Sigma-Aldrich	G5150
潮霉素 B (Hygromycin B)	Roche Group	10843555001 (20ml)
正癸醛 (N-decyl aldehyde)	Sigma-Aldrich	D7384-100G
乙醇 (Ethanol)（>99.7%）	VWR international	101077
无菌 PBS	本实验室制备	n/a
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺，25 mM HEPES）	Sigma-Aldrich	R0883
无菌蒸馏水	本实验室制备	n/a
带注射口的试管式发光检测仪（注射口为必需）	Berthold Technologies
发光检测用试管，12 × 75 mm，耐热玻璃无边口	Corning	99445-12
带通气盖的锥形瓶，无菌聚碳酸酯，250 ml	Corning	2150329
BD Vacutainer 血液采集管（不含防腐剂的肝素）	BD Biosciences	367676
50 ml 圆锥形离心管（Falcon 管）	BD Biosciences	352077
7 ml Sterilin 聚丙烯标本小管（bijou 管）	VWR international	99445-12
Sterilin 通用容器（30 ml）	Laboratory Analysis LTD	128C
玻璃珠，直径 2 mm	Sigma-Aldrich	Z143928
10 ml 移液管及移液器	任意供应商
1000μl 和 200μl 移液器及滤芯吸头	任意供应商
II 级生物安全柜
冰箱（4°C）
离心机
摇床平台（1800），用于混匀试管
轨道摇床培养箱，设定为 37°C，用于细菌培养物的扩增