在戒断期间，对与食物或药物相关线索的反应会随着时间的推移而增强，这可能与复吸行为的易感性增加有关。本文详细介绍了一种用于评估蔗糖自给大鼠中这种“渴求孵育”现象的实验方法。
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摘要
摘要
对于处于食物限制饮食状态的个体而言，食物相关线索引发的食物渴求可能成为从节制到重新摄入食物这一过程中的关键行为转折点1。以此方式定义的食物渴求，类似于药物相关线索引发的药物渴求。目前已有大量文献致力于研究药物渴求的行为学和神经生物学决定因素；我们及其他研究者近期正致力于将基础成瘾研究中的技术方法应用于进一步理解与食物相关的成瘾样行为2-4。
与以往药物渴求研究类似，我们采用大鼠复吸模型来研究蔗糖渴求行为。在此模型中，大鼠在数天内多次进行自我给药，所给物质为药物或食物。在给药阶段，按压杠杆可获得奖赏，并伴随声音+灯光刺激。渴求行为则在后续无奖赏提供的测试阶段中，以按压杠杆的反应操作性地加以定义。大鼠会稳定地对声音+灯光刺激作出反应，这很可能是因为该刺激已获得条件性强化特性5。这种行为有时被称为蔗糖寻求或线索反应性。在本文讨论中，我们将使用“蔗糖渴求”一词来涵盖上述两种概念。
在过去的十年中，我们一直关注奖赏自我给药后的时间长短如何影响对奖赏的渴求。有趣的是，在强制戒断的数周过程中，大鼠对与奖赏配对的线索的反应逐渐增强。这种“渴求的孵化”现象在那些曾自我摄取食物或滥用药物的大鼠中均有观察到4,6。我们在动物模型中发现的这种随时间推移而增强的渴求，可能对人类的药物成瘾和食物成瘾行为具有重要的参考意义。 本文介绍了一种评估大鼠蔗糖渴求孵化的实验方案。本方案包含若干变体，其中渴求的评估方式包括：在蔗糖自我给药环境中，通过消除压杆行为后对独立的蔗糖配对线索的反应来测定（无线索消除）；或在普遍的消除环境中，通过测定对蔗糖配对线索的反应来评估（有线索消除）。
方案
1. 动物实验对象
- 实验开始时，使用3月龄的雄性Long-Evans大鼠。大鼠来源于美国加利福尼亚州吉尔罗伊的Simonsen公司，在美国西部华盛顿大学动物房内繁殖，并单独饲养于12小时反转昼夜循环（光照于0700关闭）条件下，自由摄取Purina Mills Inc. Mazuri啮齿类颗粒饲料（Gray Summit, MO, USA）和水。
- 所有训练和测试均在每日0900至1300之间进行，每批大鼠每天均在同一时间段接受训练和测试。
- 在整个研究期间，大鼠每周一、三、五称重一次。
- 在训练阶段开始前，大鼠禁水约20小时，以促进其在训练第一天对蔗糖的自我给药行为。
2. 行为学实验步骤
所有操作性行为实验均使用标准操作性条件反射箱（Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA），每个操作性条件反射箱顶部均配备一个输注泵（Razel Scientific Instruments, St. Albans, VT, USA）。操作性条件反射箱置于带通风风扇（Western Washington University, USA）的隔音柜内。所有实验条件控制和数据采集均由Med PC IV软件（Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA）完成。
操作性条件反射箱（30 × 20 × 24 cm）内含两个杠杆（一个固定杠杆和一个可伸缩杠杆）、一个声音发生器、一个位于可伸缩杠杆上方的白色刺激灯，以及对面墙上的红色环境灯。输注泵将蔗糖溶液输送至活动杠杆右侧的奖励接收口。杠杆距离网格地板10 cm。每个箱体内有四束红外光电管交叉排列。前方光束距离侧壁各10.5 cm，侧方光束距离侧壁各6 cm。每束光束位于不锈钢条状地板上方4.5 cm处。光电管设置为记录完全中断光束的次数。在训练和渴求测试期间，系统记录总的光束中断次数。
除首次训练前需限制饮水外，大鼠在饲养笼和操作性条件反射箱中均可自由进食和饮水。实验在专用的测试房间内进行，该房间与动物饲养室一样，均采用倒置的光照周期。大鼠在运输过程中仍置于其饲养笼内，并使用遮光布覆盖的推车在房间之间转运。每次实验结束后，大鼠将被送回饲养笼中。
典型的实验包含三个阶段：训练期、强制戒断期和测试期。测试期是评估渴求程度的阶段。根据研究的不同，我们采用两种常规测试程序来评估渴求程度。这两种程序分别在2.3.1节和2.3.2节中进行描述。
- 训练
- 在典型实验中，大鼠连续10天每天在操作性条件反射箱中训练2小时，期间允许其按压可伸缩（主动）杠杆，以获得0.2 ml的10%蔗糖溶液，溶液被递送至杠杆右侧的 receptacle 中。
- 该按压行为还会激活一个复合刺激，包括一个声音（2 kHz，比环境噪声高15 dB）和白光。该复合刺激持续5秒，随后进入40秒的“时间暂停”期，在此期间按压主动杠杆的行为会被记录，但不产生任何程序设定的结果。
- 按压非活动性（固定）杠杆不会产生任何程序设定的结果，但按压次数仍会被记录。训练和测试期间均记录光束中断次数。所有反应行为和运动活动指标均以时间进程（每2分钟为一个时间区间）形式记录，但通常以每节实验的总次数进行报告。
- 强制戒断。大鼠在整个强制戒断期间保留在其饲养笼中。我们常用的强制戒断时间点为：训练最后一天结束后立即进行测试（强制戒断第1天），或训练最后一天结束后30天进行测试（强制戒断第30天）。
- 测试
- 无线索条件下的消退。在此测试程序中，首先让大鼠在与训练条件相同的情况下按压主动杠杆，唯一区别是按压不再产生任何结果，且实验持续时间为1小时。大鼠在测试日至少经历六次此类消退实验。每次消退实验之间间隔5分钟，在此期间主动杠杆被收回，箱内照明灯关闭。若主动杠杆按压次数减少至每小时少于20次，则表明已达到“消退”标准。部分大鼠可能需要进行第七次消退实验。在另一次5分钟延迟后，进行正式测试实验，此时大鼠可按压杠杆以触发在训练期间与每次蔗糖递送配对出现的声光线索（声音+灯光）。
- 有线索条件下的消退。在此简化的测试程序中，大鼠可在与训练条件相同的情况下按压主动杠杆，唯一区别是不递送蔗糖。
- 非活动性杠杆按压被用作衡量杠杆辨别能力的指标。同时，它与光束中断次数一起也被用于评估非特异性运动激活水平。运动性变化与动机性变化可能混淆对渴求行为的解释。非活动性杠杆按压和光束中断数据有助于区分渴求行为中运动性与动机性成分的贡献，这在药理学研究中尤为重要，例如当对高频率响应蔗糖或其他食物的大鼠施加可能影响渴求的化合物进行挑战时（如7,8）。
3. 在不同强制戒断期后影响蔗糖渴求的代表性操作方法
本文所述的通用方法提供了一种在不同时间段的强制戒断后，探究渴求行为及其神经生物学决定因素的途径。此处描述的方法与第4节中提供的代表性结果相关。
- 饱食状态。部分大鼠在测试8开始前17小时内，于其饲养笼中给予10%蔗糖溶液瓶。本研究中的大鼠采用无线索条件下的消退程序进行测试。
- 环境富集。在强制戒断期间，部分大鼠继续单独饲养（对照组），而另一些大鼠则被转移至一个较大的笼子（36 " 宽 × 20 " 深 × 40 " 高；Quality Cage Products，Portland，OR，USA）中，每笼三只组成同伴群体（富集组）。富集组动物所处环境中包含多种玩具，如PVC管材，并且每周一、三、五提供新的玩具10。本研究中的大鼠采用无线索条件下的消退程序进行测试。
- 药理学干预。在测试当天，大鼠预先给予多巴胺D1受体拮抗剂SCH 23390。本研究中的大鼠采用有线索条件下的消退程序进行测试。
4. 代表性结果：
图1 蔗糖渴求延长实验中代表性的训练与测试数据。
数据点表示均值 ± 标准误。图1a的组大小为77只大鼠，图1b中每组的组大小为11-12只。*表示与第1天组相比具有显著差异，p < 0.05。本图经Springer许可，改编自文献8中的数据。
图2 蔗糖饱食对强制戒断1天或30天后蔗糖渴求的影响。每组动物数量为8-9只。*表示与第1天组相比具有显著差异，†表示与对照组相比具有显著差异，p < 0.05。本图经Elsevier许可改编自9。
图3 一个月的环境富集显著降低了蔗糖渴求。每组均为8只大鼠。* 表示与第1天相比具有显著差异，† 表示与对照组相比具有显著差异，p < 0.05。该图经沃尔特斯·克鲁维尔健康公司许可，改编自文献10。
图 4 全身给予 SCH 23390 在强制戒断一天后更有效地降低了蔗糖渴求。每组动物数量为 8–12 只。* 表示与第 1 天组相比具有显著差异，† 表示与 0 剂量组相比具有显著差异，p < 0.05。该图经 Springer 授权改编自文献8。
- 图1显示了大鼠自给蔗糖（图1 上图）以及在消退期可获得与蔗糖配对的线索时的反应情况（图1 下图）的代表性训练和测试数据。如图所示，大鼠在训练期和测试期均选择性地按压活动杠杆。有趣的是，非活动杠杆按压和运动活动表现出一定程度的渴求增强现象，但该效应在活动杠杆按压行为上最为显著。
- 图2展示了在强制戒断1天或30天后，蔗糖饱食对蔗糖渴求的影响。无论在何种戒断时长下，饱食均能降低无线索条件下的消退反应；但仅在仅经历1天强制戒断的大鼠中，饱食可降低对单独蔗糖线索的反应。
- 如图3所示，环境富集将戒断后出现的无线索消退反应及单独对蔗糖线索的反应行为水平降低至仅经历1天强制戒断后的程度。
- 图4显示了SCH 23390对带线索消退反应的戒断依赖性效应。SCH 23390在戒断1天后比戒断30天后更能有效减少蔗糖渴求。
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讨论
我们在此描述的实验程序可被视为复现程序，尽管从技术上讲这一说法并不准确，因为在渴求测试阶段之前，并未对与线索相关的压杆行为进行消退。在典型的复现程序中，与奖赏相关联的线索引发的反应会先经过消退，随后通过非条件性地给予奖赏（奖赏启动诱导的复现）或施加应激刺激（如足底电击，即应激诱导的复现）使其“复现”11。仅对压杆行为进行消退后再次提供线索（步骤2.3.1）是最接近复现程序的操作。然而，我们所描述的程序可用于测量针对与蔗糖配对线索的目标导向反应。从操作定义上讲，这种行为即为线索增强的“渴求”行为，可能与复吸行为相关4,12-14。
与无线索灭绝后接线索接触程序（第2.3.1项）相比，带线索灭绝程序（第2.3.2项）具有一些实际优势。采用后一种方法时，部分大鼠在六次训练 session 内无法达到灭绝标准，因而需要额外增加一次灭绝训练 session。相比之下，2 h 带线索灭绝程序为渴求评估提供了可预测的时间框架，因此更适用于需要在不同受试者和实验条件下保持自我给药环境暴露一致的研究设计。此类研究的一个实例是：在渴求测试 session 结...
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披露
所有操作均遵循《实验动物护理原则》（NIH出版物第86-23号）中规定的指南，并经西华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。
致谢
本论文和视频的制作得到了美国国家药物滥用研究所/美国国立卫生研究院资助 R15 DA016285-02、西华盛顿大学神经科学生物医学研究活动计划以及西华盛顿大学的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 富集笼 | Quality Cage Company | FH-36½T-N | |
| 操作条件箱 | Med Associates, Inc. | MED-008-CT-B3 | |
| SCH 23390 | Sigma-Aldrich | D054 |
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重印与许可
