利用光学反射和自发荧光信号成像小鼠嗅球中的气味诱发活动

摘要

本文介绍了固有光学信号和黄素蛋白自体荧光信号成像的技术方案，用于绘制小鼠嗅球表面由气味诱发的神经活动图谱。

摘要

在大脑中，感觉刺激会激活功能模块中广泛分布的神经元群体，这些神经元参与刺激信息的编码。功能性光学成像技术能够以高空间分辨率可视化这些模块在感觉皮层中的激活状态，具有显著优势。在此背景下，源于与神经能量代谢相关的分子机制的内源性光学信号，是记录啮齿类动物大脑大范围感觉刺激空间图谱的有价值的对比信号来源。

在此，我们介绍两种基于脑组织激活过程中内源性光学特性变化的技术。首先，内在光学信号（IOS）由红光反射率的局部改变产生，其原因包括：（i）血液氧合水平和血容量变化引起的光吸收；（ii）光子散射。该技术的使用 体内 20世纪80年代中期，通过观察大鼠触须桶状区和猫视觉皮层方位柱的光学图谱，开始利用内源信号光学成像（IOS）记录空间图谱¹后来，Larry Katz 团队通过成像技术展示了啮齿类动物主嗅球（OB）表面在气味分子刺激下的内在光学信号（IOS）反应。²第二种方法依赖于黄素蛋白自体荧光信号（FAS），该信号源于这些线粒体代谢中间产物氧化还原状态的变化。更准确地说，该技术基于组织在蓝光激发下，氧化态黄素蛋白产生的绿色荧光。尽管此类信号可能早在布里顿·钱斯（Britton Chance）及其同事的开创性研究中，就被记录为用于研究脑活动的首批荧光分子之一³直到最近，它们才被用于脑激活图谱的绘制 体内FAS成像最初由Katsuei Shibuki团队应用于啮齿类动物的体感皮层，以响应后肢足底刺激⁴.

嗅觉系统对绝大多数生物物种的生存至关重要，因为它能够有效检测和识别环境中的化学物质（如食物、捕食者）。嗅球是大脑中嗅觉信息处理的第一级中继站，接收来自初级嗅觉感觉神经元的传入投射，这些神经元负责检测挥发性气味分子。每个感觉神经元仅表达一种类型的气味受体，而携带相同类型受体的神经元会将其神经突起投射至嗅球内相同且界限明确的微区 ˜100μm³ 由离散的神经毡构成的嗅小球 （图 1）在过去的十年中，IOS成像技术推动了对嗅球功能的探索^{5, 6, 7} 已成为最受关注的感觉结构之一。目前尚未开展利用FAS成像技术对OB活动进行映射的研究。

本文展示了用于小鼠嗅球中气味诱发活动成像的高效IOS和FAS成像方案的连续步骤。

方案

1. 准备用于成像的动物（遵循欧洲关于实验动物护理与使用的推荐标准，86/609/EEC指令）

1. 6至8周龄的C57BL/6雄性小鼠通过腹腔注射氯胺酮（10 mg/kg）和赛拉嗪（100 mg/kg）混合物进行麻醉。当小鼠对后肢足垫夹捏无反应时开始手术。整个实验过程中，动物均置于加热垫上，持续监测并维持体温于 37°C在整个手术和成像过程中，通过检查是否缺乏肢体回缩反射来维持麻醉深度。必要时，给予初始麻醉混合物剂量的20%作为皮下注射。
2. 使用剪毛器去除头皮上的毛发。用浸有生理盐水的无菌纱布擦拭暴露的皮肤，清除残留的毛发。
3. 将小鼠置于立体定位仪框架中。鼻部需与头部后方处于同一平面，以使嗅球表面保持水平。牢固固定耳杆和鼻杆，防止成像过程中动物移动。
4. 在动物眼部涂抹眼用软膏，以防止眼睛干涩和疼痛。
5. 对所有外科手术器械进行消毒 70° 用碘伏对乙醇和头皮区域依次进行擦拭。
6. 去除覆盖颅骨的皮肤时，首先用剪刀在头后部两耳之间的皮肤上做一剪口。然后分别向耳根部两侧以及沿眼睑向额部的前后方向剪开皮肤。最后在靠近鼻杆的吻部顶端皮肤处剪开，完成头皮的去除。
7. 在双目镜观察下，用生理盐水浸湿的棉签轻轻剥离颅骨顶部的骨膜。用镊子清除残留组织，并用手术刀刮除颅骨表面，以获得干净的制备面。
8. 嗅球（OB）是一个对称结构，由两个位于眼睑之间的半球形嗅半球组成。嗅半球在头侧和尾侧均以静脉窦为界，并由矢状缝分离。将一块用蒸馏水浸湿的可吸收明胶海绵置于嗅球上方的骨面上。在整个实验过程中保持该骨区域湿润至关重要。

2. 准备颅窗

1. 移除明胶海绵，然后从轻柔刮除骨组织开始°10号手术刀片。保持恒定的角度 45° 在刀片与骨骼之间操作时，将刀片从眼睑移至眼球区域的矢状侧面。切勿对骨骼施加垂直压力，或刮擦静脉窦上方的骨骼。
2. 在减薄过程中，每5分钟暂停一次，将浸湿的明胶海绵置于骨组织上以冷却样本。用海绵擦拭颅骨以清除骨屑。
3. 交替进行刮除和冷却，直至观察到小梁骨，即疏松骨层。此时嗅球的精细血管结构必须清晰可见。停止刮骨，改用手术刀尖端垂直向下“画”出一个矩形区域，将嗅球完全包围。此时°可使用11号手术刀片。手术操作应限制在静脉窦范围内进行，以确保任何刀片操作均不会损伤静脉窦。
4. 使用手术刀通过连续动作逐渐挖掘形成矩形沟槽。定期擦拭手术刀尖端以保持清洁和锋利。特别注意刀尖的深度，避免接触硬脑膜表面。
5. 为了评估残留骨质的厚度，可用镊子尖端轻轻按压。若骨瓣在压力下发生折叠，则进入下一步操作。
6. 在盐水滴下，用手术刀刀尖水平向上抬起骨瓣。移除骨瓣时需小心操作，以避免撕裂残留的骨组织。
7. 一旦暴露嗅球表面，需检查是否无出血或血管吻合存在。损伤硬脑膜或组织表面会降低获取光学信号的可能性。用生理盐水浸湿的明胶海绵擦拭该区域，以保持嗅球湿润。
8. 使用聚丙烯酸酯牙科粘固剂在开窗周围的骨组织上构建一个围堰。
9. 在硬脑膜上滴加一滴低熔点琼脂糖（1.2%），并将一块无菌盖玻片覆盖在窗口区域。成像过程中可添加少量琼脂糖以补偿干燥。琼脂糖可防止嗅球随呼吸移动，并为光学成像提供平整的表面。

3. 用于嗅觉活动图谱绘制的光学成像装置

1. 必须使用嗅觉仪精确控制嗅觉刺激的时间和强度。我们采用的是 Automate Scientific 公司生产的 Valvebank 8II 多通道灌注系统（经定制改装），并连接一台基础空气压缩机（压缩的可呼吸空气同样适用）。该系统可实现对外部阀门的精确且快速的控制。将纯嗅觉刺激物溶液按选定浓度溶于矿物油中。为激活背侧嗅球，通常使用己醛等醛类化合物。取适量稀释后的嗅觉刺激物（20 至 50μl）滴加于滤纸条上，并置于注射器储液腔中。通过灌注系统，由压力控制的气流被输送至系统，确保在阀门开启期间以恒定速率将含气味气流输送至动物鼻部。气味物质通过 Tygon R-3603 真空管（Saint-Gobain Corporation）输送，气流速率约为 1000ml/min。应避免不同气味物质之间的交叉污染以及管道中残留气味物质的积累。如有条件，可通过火焰离子化检测器（microFID 2020 Photovac）监测气味刺激的可重复性。
2. 开启光学成像系统。该系统包括：一个冷却式12位隔行扫描CCD相机（ORCA AG Hamamatsu）、一台荧光体视显微镜（Leica MZ16）、一台计算机控制的嗅觉仪，以及配备适当带通干涉滤光片的稳定激发光源。图2展示了本实验装置的示意图。在进行内在光学信号成像（IOSI）时，采用200W钨卤素灯（Oriel QTH）配合光纤环形灯（Schott），将光源环绕连接至显微镜物镜周围，以提供稳定且均匀的照明。在进行黄素蛋白自发荧光信号成像（FASI）时，则使用150W金属卤化物灯（Leica）配合5mm芯径液体光导，通过体视显微镜的落射照明端口实现对荧光信号的均匀局部激发。
   
   图像采集与硬件同步由自定义软件实现。也可使用开源软件 Micromanager 控制光学系统及图像采集过程。

4. 光学成像

1. 将立体定位架置于体视显微镜下，使颅窗位于视野中央（参见图2A中的光学装置示意图）。
2. 调节显微镜以聚焦于毛细血管。在刺激试验前（见第5步说明），在560 nm（绿色）光照下（光纤环）拍摄嗅球图像，该波长可为血管成像提供良好的对比度。此图像作为解剖学对照，用于评估制备状态，并在实验过程中多次采集。
3. 进行内在光学信号（IOS）成像时，在630±10 nm（红色）照明下，由CCD相机记录反射光强度。图像以全帧模式（无像素合并）采集，速率为每秒5帧，对应约150 ms的曝光时间。调节光源功率，使嗅球区域的灰度值至少达到约3000，接近CCD像素阱的饱和水平。这样做可充分利用CCD的12位动态范围，以捕捉激活期间微弱的光强变化。最大IOS信号幅度可达约1%。
4. 进行荧光散斑成像（FAS）时，在480±20 nm（蓝色）落射荧光激发光下采集荧光信号。使用515 nm的长通滤光片采集发射光。图像采集速率为每秒5帧，采用4×4像素合并以最大化灵敏度。激发光功率的调节方式与IOS相同，使嗅球区域灰度值达到3000。最大FAS信号幅度可达约3%。
   
   对于两种成像模式，物平面的景深相同，在放大倍数约为4倍时测得为0.5 mm。
5. 成像试验之间应关闭光源，以避免对组织产生加热和光漂白效应。

5. 成像实验

1. 标准成像过程包括5到10秒的基线期，期间仅输送空气，随后根据所选气味浓度进行3到10秒的气味刺激，并在之后持续记录70到82秒的恒定气流以恢复基线（图2A）。试验结束时关闭光照，并在试验间歇期（1至3分钟）持续输送纯净空气，以清除残留的气味分子并避免感觉适应。气味试验与空白试验（仅输送空气）交替进行。
2. 气味诱发的激活区域在图谱上呈现为大致球形的区域，对应单个肾小球的尺寸（直径80至200μm⁹）。图像处理方法见图2B。嗅觉图谱展示于图3。与其他任何感觉系统不同，嗅球中的信噪比足以在单次试验中分辨出气味诱发的反应（图3B为IOS结果，图3D为FAS结果）。
3. 成像实验结束后，按照欧洲关于实验动物护理与使用的推荐方法立即对小鼠实施安乐死。

6. 代表性结果（见图3中的嗅觉图谱）：

图 1 啮齿类动物主嗅球的结构组织。位于主嗅上皮中的嗅觉感觉神经元是初级感觉细胞，表达相同的气味受体，并汇聚至嗅球（OB）中的同一肾小球。嗅小球呈圆形神经纤维团（虚线圆圈），位于OB表面。请注意，在肾小球水平存在非常密集而复杂的血管网络。缩写（从上到下）：ONL：嗅神经层；GL：肾小球层；EPL：外丛状层；MCL：僧帽细胞层；GCL：颗粒细胞层。

图2 体内反射光与荧光信号记录。A. 宽场光学成像装置。通过连接在光学镜头上的环形光纤环或显微镜的落射照明端口，将红光（IOS）或蓝光（FAS）照射至麻醉小鼠暴露的大脑。气味物装载于密封小瓶中，并通过气流将含气味空气输送至动物鼻部（绿光：阀门打开）。B. 记录流程与数据处理。IOS和FAS以一系列独立实验（每次持续90秒）的形式进行记录。图中显示单次实验的时间线：基线期持续5至10秒，刺激期持续3至10秒，恢复至基线期持续70至82秒。图像处理需对FAS在刺激期间、或对IOS在刺激期加恢复期的像素强度值，逐像素减去基线期的强度值。该差值再除以基线期数值，以获得百分比变化（见图3中的结果图像）。

图 3 使用 IOS 和 FAS 成像技术获得的小鼠嗅球（OB）中气味诱发的活动图谱。A. 在绿光下观察到的背侧嗅球的血管结构。B-C. 对同一小鼠分别进行单次试验和三次平均试验的IOS成像，刺激条件为10秒暴露于20%浓度的己醛。白色箭头指示由该气味激活的球形感兴趣区域。这些激活图谱是通过气味刺激结束后第一秒内平均帧图像获得的（反射率变化最大值：A中为-0.63%，B中为-0.52%）。注意图中黑色区域表示因气味激活导致的吸光度增加。C-E. 在同一小鼠中针对相同气味物质依次获取的FAS图像（分别为单次试验与三次平均试验）。这些激活图谱是通过气味刺激开始后第一秒内平均帧图像获得的（荧光变化最大值：D中为+0.72%，E中为+0.66%）。请注意，FAS图像中由黑色箭头指示的白色自体荧光发射区域，对应于IOS图像中的黑色区域。FAS图像中可见的颗粒状外观是由于为提高灵敏度而采用的4×4像素合并所致。FAS图像未校正自体荧光漂白效应。图像B-E的实际尺寸：0.7 mm 宽 × 1.2 mm 长。

讨论

本文中，我们介绍IOS和FAS成像技术 体内 记录小鼠嗅球中由气味诱发的活动。为实现这一目标，需要一个相对简单且经济的宽场光学成像系统。成像数据的获取需要经过训练以完成精细的手术操作，并避免对硬脑膜或脑组织造成损伤。特别是大出血会吸收成像所记录的光子，导致实验终止。

IOS 和 FAS 成像的一个优势是避免了荧光示踪剂的注射，从而防止可能引起的细胞毒性或不良副作用。这些技术使得研究嗅觉图谱以及感觉刺激的空间编码问题成为可能。与 2-脱氧葡萄糖成像不同，它们能够在同一只动物体内对多种气味进行成像。然而，由于光子在组织中的穿透深度有限，IOS 和 FAS 仅限于嗅球的背侧区域，无法记录腹侧区域的信号。

内源性光学信号成像可提供优异的空间分辨率 体内 成像。技术改进涉及反射信号中血管成分的定量计算^8,9 以及感觉激活期间血氧水平和血容量的动态变化¹⁰多波长成像技术目前在我们实验室正被开发用于在感觉激活期间对嗅球中的总血红蛋白浓度和氧合状态进行完全量化。将这些光谱光学测量与FAS成像相结合，将有助于揭示感觉激活过程中血管动力学与细胞内动力学之间尚未明确的关系。^11,12.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊马基因	Merial
隆朋	Bayer AG
琼脂糖，III-A型	Sigma-Aldrich	A9793-50G
己醛 98%	Aldrich	115606-100ML