在小鼠嗅球成像气味诱发的活动，利用光学反射和自体荧光信号

摘要

本文介绍了内在的光信号和flavoproteins自体荧光信号成像的协议，在小鼠嗅球表面的气味诱发的地图活动。

摘要

在感官刺激大脑，激活分布式参与刺激的编码的功能模块之间的神经元的数量。功能光学成像技术，是有利的可视化这些模块的高空间分辨率的感觉皮层的激活。在这种情况下，挂钩neuroenergetics的分子机制产生的内源性光信号对比的宝贵来源，记录在啮齿动物的大脑宽领域的感官刺激的空间地图。

在这里，我们目前两种技术的基础上在激活过程中的脑组织内源性的光学特性的变化。首先，由于在红光反射的地方改建生产的内在（IOS）的光信号:（一）吸收血氧水平和血容量（二）光子散射的变化。 体内 IOS来记录空间地图observati在20世纪80年代中期开始晶须万桶的光学地图在大鼠和猫视觉皮层的方向列。后来证明拉里-卡茨的第²组的IOS到气味的啮齿动物的主要嗅球（OB），表面成像。第二种方法依赖于黄素蛋白自体荧光信号（FAS）由于在这些线粒体代谢中间体的氧化还原状态的变化。更确切地说，该技术是基于绿色荧光，因为当组织与蓝色光激发氧化状态flavoproteins。虽然这种信号可能布里顿机会和他的同事³先驱研究大脑活动的研究记录的第一个荧光分子之间，直到最近，他们已被用于脑激活体内的映射。 FAS的成像是首次应用在啮齿类动物的体感皮层hindpaw Katsuei Shibuki的第⁴组的刺激。

嗅觉系统是因为它可以有效的检测和鉴定环境中的化学物质（食物，天敌）的绝大多数生物物种的生存至关重要的。 OB的是大脑中的嗅觉信息处理的第一个继电器。它接收从检测挥发性气味分子的嗅觉主要的感觉神经元传入的预测。每个感觉神经元对气味受体和携带同一类型的受体的神经元，送他们的神经过程^〜100μm的3相同的定义良好的微区， 嗅觉小球（图1）离散的神经纤维构成的一类。在过去的十年中，IOS成像促进OB ^的5，6，7这已成为一个研究最多的感官结构功能的探索。转播活动与FAS成像的映射尚未执行。

在这里，W发送一个有效的协议显示IOS和FAS成像的连续步骤，在小鼠的OB地图的气味诱发的活动。

方案

1。准备成像的动物（按照欧洲实验动物护理和使用建议，86/609/EEC指令）

1. 6日至8周龄雄性小鼠C57BL6与intraperitonealy鸡尾酒注射氯胺酮（10mg/kg的）和甲苯噻嗪（100mg/kg）麻醉。手术开始，当鼠标不再响应hindpaw捏。在整个实验动物被放置在一个加热垫。不断监测和体温保持在37 ° C。麻醉深度维持整个手术和成像会议通过检查出肢体的情况下退出。否则管理的一个皮下注射20％的初始麻醉鸡尾酒。
2. 使用指甲钳，去除头发从头皮。从暴露的皮肤上残留的头发清洁，用无菌纱布，用生理盐水浸泡。
3. 鼠标放置在立体框架。口鼻部的后脑勺在同一平面上，为了设置嗅球表面的水平。安全牢固的耳朵和鼻子的酒吧，以防止在成像过程中的动作。
4. 应用动物的眼睛眼药膏，以防止干燥和疼痛。
5. 与70 °乙醇和连续扫描的优碘的头皮面积消毒手术器械。
6. 要删除的皮肤覆盖的头骨，开始通过在皮肤上，用剪刀在两耳之间的头回的一个切口。然后切在双方对基地的耳朵和眼睑对前额沿前后方向。完成切割吻靠近鼻子栏上的皮肤去除头皮。
7. 根据双眼观察，用生理盐水浸泡的棉签，轻轻取下的头骨上方的骨膜。使用一双镊子去除剩余的组织用手术刀刮去表面的头骨有一个干净的准备。
8. OB的是位于眼睑之间的两个hemibulbs组成的对称结构。他们只限于在延髓尾方向由静脉窦，矢状缝分离。放置一个用蒸馏水浸泡在上述OB的骨片吸收明胶海绵。重要的是要保持这个骨面积在整个实验湿润。

2。准备颅窗口

1. 取出明胶海绵和启动N ° 10手术刀刀片轻轻刮骨。保持45 °之间的刀片和骨不断的角度，从眼睑移动灯泡区矢状面刀片。不要适用于骨的垂直压力，或从头以上的静脉窦骨。
2. 在变薄的过程中，停止每5min和地方水合对骨明胶海绵降温的准备。棉签，用海绵去除骨灰尘的头骨。
3. 保持清扫和冷却或者直到可视化的小梁，松质骨层。 OB的细血管，必须在这个阶段中可见。停止刮伤骨，并开始使用手术刀的尖端垂直，以"画"一个矩形区域封闭的OB。在这个阶段，N ° 11手术刀刀片都可以使用。保持应该是安全的任何手术刀中风的静脉窦范围内的手术。
4. 逐步形成的矩形沟槽挖掘使用手术刀连续运动。擦拭手术刀定期清洁，并保持锋利的尖端。要格外小心的提示，以避免接触硬脑膜表面的深度。
5. 为了得到剩余的骨厚度感，一双镊子尖轻轻推。如果骨瓣褶皱的压力下，移动到下一个步骤。
6. 根据一滴生理盐水，用手术刀化的尖端水平抬起骨瓣。切除皮瓣做彗星arefully，以避免撕掉剩余的骨。
7. OB的表面暴露后，检查没有任何出血或血管吻合。受伤的硬脑膜或组织表面会降低获取光信号的机会。用明胶海绵在盐水中浸泡，以保持灯泡湿润的地区。
8. 应用聚丙烯牙科水泥周围的骨形成一个很好的窗口。
9. 将低熔点琼脂糖（1.2％），硬脑膜下降，并把在窗口尺寸的无菌玻璃盖。成像会议期间，一个可以添加少量琼脂糖，以弥补的干燥。琼脂糖防止随呼吸移动的OB和光学成像将提供一个平坦的表面。

3。嗅觉活动映射的光学成像装置

1. 在时间和强度，使用嗅觉的嗅觉刺激，必须准确界定。我们使用自定义修改的multivial灌注系统Valvebank 8II的自动化科学的一个基本的空气压缩机（压缩呼吸的空气将被视为适合）相关的版本。该系统可以准确，快速的外部阀门控制。在选定的浓度纯气味的解决方案是在矿物油稀释。要激活的醛，如背转播醛常用。一个精密量的稀释气味（20至50μL）装上滤纸，并放置在一个注射器水库。通过灌注系统，压力控制空气传送系统，确保恒定的速率odorized空气流量交付期间阀门的开度的动物鼻子。气味是透过一个聚乙烯的R - 3603真空管账面〜1000ml/min的流量空气（圣戈班公司）。避免油管之间的气味和残留量的气味污染。如果可用，气味刺激的重复性，可控器lled通过火焰离子化检测器的使用（microFID 2020 Photovac）。
2. 光学装置已开启。它由一个冷却隔行12位CCD相机（ORCA的AG滨松市）的荧光体视显微镜（莱卡MZ16），计算机控制的嗅觉和适当的带通干涉滤光片稳定的励磁灯。一个计划，说明我们的设置是在图2。对于内在的光信号成像（IOSI），一个200W的卤钨灯（奥丽尔QTH），加上一个光纤环光（肖特）插入显微镜围绕目标是用来提供稳定，甚至照明。对于一个150W的金属卤化物灯用5mm的核心液体光导（徕卡）黄素自体荧光信号成像（法祀），提供通过外延的立体显微镜照明端口甚至本地化激发的荧光。

   定制软件实现图像采集和硬件同步。开放型的ource软件事无巨细，也可用于控制光的设置和收购。

4。光学成像

1. 广场的体视显微镜下的立体框架，视野为中心的颅窗口（见图2A光学装置的原理）。
2. 调整显微镜专注于毛细血管。之前刺激试验（见说明5）灯泡的形象是560nm（绿色）的光（光纤环），它提供了一个良好的血管成像对比下。这张照片是用来作为解剖对照检查的准备状态，并在实验过程中获得了好几次。
3. 为iOS成像，反射光的强度是由CCD相机记录下630 + / -10纳米（红色）照明。图像采集全帧每秒5张，对应于约150毫秒的曝光时间（不分级）。光源功率调整，重新 ACH至少〜3000级灰度的OB区，接近CCD像素井的饱和度。这样做，使人们有可能采取"防治荒漠化公约"的12位动态的优势，在激活过程中捕捉到微弱的强度变化。最大的IOS幅度达到〜1％。
4. 对于FAS成像荧光激发480nm + / - 20nm的（蓝色）epiflurorescence光下获得的。在515nm的高通滤波器设置捕捉光线。在每秒5帧的图像采集与分级为4 4，最大限度地提高灵敏度。同样激发光功率调整到IOS上的OB区3000级灰度。最大FAS的幅度达到〜3％。

   对于这两种成像方式，在受平面的领域深入是相同的，在0.5毫米测量放大4倍左右。

5. 光线应打开之间的成像试验，以避免加热和漂白的准备。

乐"> 5。成像试验

1. 标准成像会议包括只有空气是交付10秒5的基准，其次是取决于所选择的气味的浓度，70至82S的10S，进一步记录为基线恢复恒定的空气流动（图3的气味刺激2A）。在试验结束时，光关闭，纯净的空气交付间审判间隔时间（1〜3分钟）洗出残留气味分子，并避免感官习惯。气味试验交错空白试验（空中传送）。
2. 气味诱发的激活区在地图上的球状地区的可视化和对应的个别肾小球的大小（80 ^至 200微米直径9）。图像处理解释图2B。嗅觉的地图是图3中。相反，任何其他感官系统，在OB信号信噪比足以解决在单一试验的气味诱发反应（图内部监督办公室和图3B。 FAS的3D）。
3. 小鼠安乐死立即按照欧洲实验动物护理和使用建议使用方法的成像会议结束。

6。代表性的结果（参见图3中的嗅觉地图）:

图1主要在啮齿类动物中的嗅球的组织结构。嗅感觉神经元，位于主要的嗅觉上皮的初级感觉细胞，表达了同样的气味受体和收敛到相同的肾小球在OB。嗅觉肾小球圆形neuropils（虚线圆圈），分别位于表面的OB。需要注意的是一个非常密集和复杂的血管网肾小球。缩写（顶/下）:ONL:嗅神经层; GL:肾小球层，英超:外部网状层; MCL:僧帽细胞层;保利协鑫:颗粒细胞层。

图2反射荧光信号，并记录在体内。 A.宽领域的光学成像设置。暴露于麻醉小鼠的大脑，任红（IOS）或蓝色（FAS）的光通过一个环形光纤环连接到光学镜头或显微镜EPI照明端口。气味装入密封的小瓶和odorized空气传递到动物的鼻子（绿灯:开阀）。 B.记录协议和数据处理。 IOS和FAS系列（工期90年代）个别试验记录。该图显示了审单的时间表:基准变化5至10秒，从3到10秒的刺激，并回到基线，​​从70到82S。图像处理要求像素由像素强度值的加减在基准强度值（FAS）的刺激期间Øř刺激加回到基线（IOS）的。这种差异是基准值再除以获得％的变化（图产生的图像 。） 。

图3中的气味诱发电位在OB活动地图使用IOS和FAS成像。 A.背OB血管可视化下大开绿灯。公元前。 IOS映像（审单，分别与三个平均试验）为20％的醛10S介绍。白色箭头表示这气味激活的球形地区的利益。这些激活地图使用帧平均气味刺激结束后，在第一第二（A和-0.52％，在B中最大的反射率变化-0.63％）。注意吸光度的气味激活发生的黑区。光盘。 FAS的收购顺序相同的气味（审单与三个平均试验分别在相同的鼠标LY）。这些激活地图使用帧平均气味刺激开始后，在第一秒（荧光变化0.72％，在D和0.66％，在E最大）。需要注意的是对应的自体荧光发射的黑色箭头所指的白色区域在IOS黑区。在FAS地图看到粒状方面是由于4分级要求的灵敏度提高到4。 FAS的图像不纠正，从自体荧光漂白。图像的实际尺寸:0.7 mm宽x长1.2毫米。

讨论

在这篇文章中，我们目前在体内的气味诱发的活动，在鼠标的OB录音的IOS和FAS成像技术。为了实现这一目标的一个相对简单的和负担得起的的宽视场光学成像设置是必要的。成像数据采集要求的训练，以执行精细的外科手术，并避免任何损伤硬脑膜或脑组织。特别严重出血会吸收光子成像记录，并结束实验。

IOS和FAS成像的一个好处是避免注射荧光示踪剂，可能会导致细胞毒性，副作用。他们使人们有可能解决有关空间的感官刺激，从而编码嗅觉地图问题。 2 - 脱氧葡萄糖成像相反，他们提供了可能性，在一个单一的动物形象几个气味。然而，由于光子穿透组织的限制，内部监督办公室和FAS限制背部分的OB不能记录从腹地区。

内源性光信号成像提供了极好的体内成像的空间分辨率。技术改进所关注的血管成分的定量计算的反射信号在^感官的活化10 8,9以及动态血氧和体积。多波段成像的IOS成像方法目前在我们的实验室开发，充分量化总血红蛋白浓度和氧合在OB在感官激活。这些添加到FAS的成像光谱光学测量，将给予回答的机会在感官^激活 11,12之间的血管和细胞内动态未解的关系。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丽晶酒店的名称	公司	目录编号
Imalgene	梅里亚
Rompun	拜耳
琼脂糖，类型III - A	Sigma - Aldrich公司	A9793 - 50G
醛98％	爱秩序	115606 - 100ML