microRNA（miRNA）是基因表达的重要调控因子，已被证明在多种生物学过程中发挥作用。为了更深入地理解miRNA与非翻译区（UTR）之间的相互作用，我们构建了一个全基因组范围的3' UTR荧光素酶报告系统文库，并结合了一种新型荧光素酶基因及检测试剂——LightSwitch系统。
方法文章
利用3'非翻译区报告基因构建体和microRNA模拟物在贴壁细胞中使用LightSwitch荧光素酶检测系统鉴定人类microRNA靶标
本文内容
摘要
摘要
微小RNA（miRNA）是基因表达的重要调控因子，在多种生物学过程中发挥重要作用。迄今为止已鉴定出700多种人类miRNA，每种miRNA可能具有多达数百个独特的靶mRNA。计算工具、表达谱分析、蛋白质组学检测以及基于染色质免疫沉淀的技术为鉴定特定miRNA的直接靶mRNA提供了重要线索。此外，3'非翻译区（3'UTR）报告基因检测已成为全面研究miRNA靶标的重要组成部分，因其可在基于细胞的系统中为特定miRNA与3'UTR的相互作用提供功能性证据并量化其效应。为了使更多研究人员能够应用3'UTR报告基因检测，并支持此类检测向高通量水平扩展，我们已在高度优化的LightSwitch荧光素酶检测系统中构建了覆盖全基因组的人类3'UTR荧光素酶报告基因文库。该系统还包括合成的miRNA靶标报告基因载体，用作阳性对照，以及多种内源性3'UTR报告基因载体和一系列标准化实验方案。
本文介绍一种高效、可重复且适用于高通量分析的共转染方法，即将单个3'非翻译区（3'UTR）报告基因载体与miRNA模拟物共同转染细胞。
方案
引言
microRNA 已被证实是基因表达的重要调控因子，能够调节许多重要生物学过程的活性。迄今为止已鉴定出超过 700 种人类 miRNA1，因此不难理解，miRNA 的突变及其调控异常已被证实与多种生理紊乱相关，例如癌症和心脏病2,3。近期研究表明，大多数 miRNA 调控结合位点位于 3'非翻译区（3'UTR）4,5，一些研究者估计，每种 miRNA 在细胞中可能有数百个靶标6。鉴于 miRNA 具有重要的生物学意义、数量庞大且每种 miRNA 均具有大量靶标，研究人员迫切需要能够可靠地鉴定 miRNA 的内源性靶标，最好是在适用于高通量研究的平台上实现。
在使用 miRBase、TargetScan 和 PicTar 等计算工具时1,6,7 是生成任何miRNA的假定mRNA靶标列表的有效方法，但目前这些预测的准确性尚不足以单独依赖8因此，研究人员还利用多种实验方法来鉴定靶标 从头合成 或用于验证预测的靶基因。许多研究团队依赖对稳态 mRNA 或蛋白质水平的高通量检测，以鉴定在 miRNA 活性受到干扰时表达发生变化的基因4,9,10此类变化无疑具有重要的生物学意义，并且代表了一个关键的初步步骤，然而，仅测量整体表达水平的变化无法区分miRNA对转录本的直接作用与间接或下游信号通路的影响。其他可用于提供miRNA-mRNA直接相互作用证据的有力工具是染色质免疫沉淀（ChIP）策略，该方法通过交联argonaute蛋白（从而RISC复合物）与miRNA及mRNA，实现相互作用分子的捕获；然而，鉴定出结合伙伴并不意味着可立即推断此类结合事件的功能性效应。5,11因此，能够为miRNA对特定UTR的作用提供功能证据的3'UTR报告基因实验已成为全面开展miRNA研究的重要组成部分。将此类基于细胞的实验数据与计算预测的靶点信息或表达谱及蛋白质组学数据相结合，可为特定3'UTR直接受目标miRNA调控提供有力证据。
在3'UTR报告基因检测中，将目的基因的3'UTR序列连接至荧光素酶报告基因的末端。如果该3'UTR是miRNA的靶标，则报告基因转录本的稳定性及/或翻译效率会随功能性miRNA浓度的变化而改变。因此，与仅依赖转录本的检测方法不同，报告基因检测有助于识别对稳态mRNA水平和蛋白质水平的双重影响。报告系统还可用于研究对3'UTR中假定miRNA结合位点进行诱变后的功能效应，以验证该位点是否确实为相互作用所必需8。尽管利用表达谱芯片、蛋白质组学技术以及Argonaute蛋白的ChIP实验可在少数实验条件下提供有价值的全基因组数据，但基于细胞的报告基因检测更易于扩展，可用于研究数百乃至数千种条件下的miRNA-3'UTR相互作用，适用于小分子或其他文库类效应因子的高通量筛选。 关键词：3'UTR报告基因检测，荧光素酶报告基因，miRNA，转录本稳定性，翻译效率，基因表达调控，结合位点突变，高通量筛选，细胞实验，Argonaute ChIP
许多科学家已将报告基因检测技术应用于miRNA与3'非翻译区（3'UTR）相互作用的研究。然而，由于单个miRNA可能靶向数百种不同的转录本，研究人员很难将这一强大方法应用于高通量规模的研究，因为构建数千种不同的3'UTR-报告基因载体所需的克隆、验证和优化步骤往往成本过高。为了使小规模和大规模的3'UTR-报告基因研究对所有研究人员均具有可及性，我们构建了一套覆盖全基因组的人类3'UTR文库，这些3'UTR已预先克隆至高度优化的LightSwitch荧光素酶检测系统中。该报告基因系统还包括经过验证的对照载体、一套包含700多个合成miRNA靶标报告基因构建体的阳性对照，以及一系列标准化的实验方案。
通过以下实验方案，您可以探究特定的人类3'非翻译区（3'UTR）是否为所关注的miRNA的靶标。该实验流程的关键步骤包括实验设计、报告基因载体和miRNA模拟物的转染、荧光素酶报告基因检测以及数据分析。在实验设计阶段，需仔细选择可转染的细胞系、实验组与对照组报告基因载体，以及miRNA模拟物和非靶向对照。常见的高转染效率贴壁细胞系，如HT1080、HepG2、HCT-116、Hela、293等，通常适用于本实验方案。
实验设计的重要注意事项
LightSwitch 荧光素酶检测系统是一种完全优化的报告基因系统，包含利用 RenSP 荧光素酶基因的 GoClone 载体以及 LightSwitch 荧光素酶检测试剂。建议按照推荐方式使用 LightSwitch 系统的全部组分，以获得最佳的报告基因检测结果。
将任何寡核苷酸/质粒与SwitchGear GoClone报告基因构建体共转染，会以非特异性方式降低整体荧光素酶信号。因此，必须进行以下转染组合：仅报告基因、报告基因+非靶向对照miRNA、报告基因+特异性miRNA。
我们的空3'非翻译区载体（强启动子，无UTR）可提供极高的荧光素酶信号，可作为转染效率的阳性对照；而合成的miRNA靶标报告载体可作为mimic活性的阳性对照。此外，我们建议使用GoClone 3'UTR管家基因对照和随机对照，以准确区分序列特异性效应与非特异性效应。
仔细研究您的实验方案，尽可能配制预混液，以减少因移液误差或蒸发导致的数据变异。
本方案使用 DharmaFect Duo 转染试剂（Dharmacon）。
第1天
重要提示：谨慎选择细胞系。为获得最佳结果，请使用已知易于转染的细胞系。我们还发现，在内源性表达该特定miRNA水平较高的细胞系中，3'非翻译区报告基因对miRNA模拟物的可测量反应会减弱。如果您不清楚您的细胞系表达多少miRNA，可尝试使用SGG的合成microRNA靶标，该靶标可间接测量细胞中特定miRNA的丰度，同时告知您实验的动态范围。
1. 接种细胞，使其在转染时汇合度达到 ≥80%。
- 在96孔白色TC板中接种细胞，每孔总体积为100 µL。
- 同时，在透明的96孔板中接种相应数量的细胞，用于评估汇合度。
重要提示 1：在模拟实验中，细胞融合度是获得良好结果的关键。为实现最佳敲低效果，转染时细胞应达到 100% 融合度。
重要提示 2：为获得最佳结果，请使用低传代次数的细胞。传代次数过多的细胞往往会导致转染数据背景噪音较高。
第2天
制备 GoClonereporter 报告基因构建体和 miRNA，然后转染至汇合的细胞中。
2. 准备构建体
- 在室温下解冻 GoClone 载体（质粒 DNA）。充分混匀。
- 离心以去除管盖上的冷凝液。
3. 准备微小RNA
- 将 microRNA（特异性模拟物及非靶向对照）在室温下解冻，并离心以去除管盖上的冷凝液。
- 用无 RNase 的水稀释至 2 µM 的工作浓度。
除了实验性miRNA模拟物外， ALWAYS 需包含一个非靶向miRNA对照。共转染质粒和小RNA寡核苷酸所产生的信号低于单独转染质粒。
包含一个或多个阳性对照。可考虑使用 SGG 目录中的数百种合成 miRNA 靶标报告载体之一。
应包含一个或多个阴性对照或非特异性对照。SGG 提供多种对照，包括管家基因的 3' 非翻译区（UTR）、随机片段和/或空白对照（无 UTR 插入）。在实验组中同时使用这些对照中的一种或多种，可使您能够校正因特定 miRNA 过表达或非靶向对照所引起的任何非特异性效应。
4. 准备转染
- 每次转染请按以下试剂组合进行单次检测：
混合物1
| 单个 GoClone 报告基因： | 3.33 µL |
| microRNA： | 视情况而定* |
| 无血清培养基： | 加至 10 µL |
* miRNA 的有效浓度范围为 10 nM–100 nM。请参考 miRNA 生产商提供的适当浓度建议。
重要提示：不要加入过多的mimic。在最终100 µL反应体系中，mimic的适宜浓度范围为10–50 nM。
每种处理/UTR组合至少进行三次重复转染，并额外增加体积以弥补移液误差。
例如，将单个反应体积乘以 3.5，以获得足够的转染混合物，用于 3 个重复转染孔，并额外预留移液误差或蒸发损失的用量。
针对每个报告基因，需设置以下重复组：仅报告基因组、报告基因 + 非靶向对照 miRNA 组、报告基因 + 特异性 miRNA 组。
在进行靶向 microRNA 转染的同时，设置非靶向对照组的转染。
- 为每次转染按下述方法配制 DharmaFECT DUO（Dharmacon）混合液：
混合物2
| DharmaFect Duo: | 0.15 µL |
| 无血清培养基: | 9.85 µL |
添加的 DharmaFECT Duo 用量可能因细胞系而异。
上述所示用量适用于 HT1080 细胞。
请查阅制造商的说明书，以确定适用于您细胞系的合适用量。
提示：通过将上述体积乘以待检测的报告基因数量、重复次数以及miRNA数量，来配制大量转染混合液。在计算所需转染混合液体积时，务必额外加入少量液体，以弥补移液误差和蒸发损失。
- 将 DharmaFECT Duo 混合物在室温下孵育 5 分钟。
- 5 分钟后，向每管已准备好的 10 µL 质粒和/或 miRNA（混合物 1）中加入 10 µL DharmaFECT Duo 混合物（混合物 2）。每管最终体积应为每次转染 20 µL。
- 将各混合物在室温下孵育 20 分钟。
- 20 分钟后，向每管中加入 80 µL 预热（37°C）的无抗生素完全培养基，使每次转染总体积达到 100 µL。可使用深孔板同时准备多个重复和样品。用移液器吹打混匀溶液。
- 从培养箱中取出已接种细胞的培养板，确认细胞融合度至少达到 80%。
- 小心地用移液器吸除各孔中的培养基。
- 向每孔中加入 100 µL 转染混合物（20 µL DNA/试剂混合液 + 80 µL 培养基）。
- 将培养板放回培养箱中过夜培养。
不要过度孵育。大多数模拟物在24小时内即可对真实靶标产生显著效果。48小时时可测得的抑制水平可能更高，但孔间变异也会随之增加。
模拟物实验比抑制剂实验更容易。大多数模拟物在24小时内即可显著抑制其真实靶点，而由抑制剂引起的显著去抑制效应通常需要48小时才能被检测到，且其效应几乎总是弱于模拟物的作用。
第3天
注意：荧光素酶检测可立即进行，也可将培养板置于 -80°C 冻存（冻存通常可增强细胞裂解和荧光素酶信号）。为获得最佳结果，建议在检测前进行细胞冻融处理。
请记住，在加入 LightSwitch 检测试剂前，需将冷冻细胞解冻至室温。
5. 使用 LightSwitch 检测试剂测定荧光素酶活性
- 从培养箱中取出培养板，恢复至室温。
- 准备 LightSwitch 检测试剂（LS010 试剂盒的说明如下，其他规格试剂盒的方案可在线查询）：
- 向冻干的检测试剂管中加入 100µL 底物溶剂，重悬 100X 底物。 避光操作，并尽量减少在室温下的暴露时间。100X 底物可在 -20°C 保存 2-3 周。为获得最佳结果，建议使用 freshly reconstituted 底物。
- 将 10mL 瓶装检测缓冲液在室温水浴中解冻，使用前加入 100µL 重悬后的 100X 底物，充分混匀，制成检测溶液。
- 使用多通道移液器将 100µL LightSwitch 检测溶液（缓冲液 + 底物）直接加入白色 96 孔板的每个样品孔中（每孔含 100µL 细胞与培养基）。 若细胞在其他培养板或培养瓶中培养，请将样品转移至白色 96 孔板，总体积为 100µL（可用培养基或 PBS）。
- 用盖子封板，避光，于室温孵育 30 分钟。 若同时检测多个培养板，应错开检测溶液的加入时间，确保每块板在读数前均有 30 分钟的孵育时间。
- 使用酶标仪（SpectraMax L 或同等仪器）对每孔进行 2 秒的发光检测。
- 通过计算每个构建体在特定 miRNA 条件下与非靶向对照的荧光素酶信号比值（发光值 = 特定 miRNA / 非靶向对照），确定基因敲低效率。利用管家基因、随机序列及空载体构建体的数据，排除非 UTR 特异性处理效应的影响。
代表性结果
在存在靶向miRNA的情况下，3'UTR靶点显示出荧光素酶的表达下调。
通过共转染100 ng的每种报告载体与20 nM的let-7a模拟物或非靶向对照，在HT1080细胞中检测let-7a对3'非翻译区-荧光素酶报告基因活性的敲低效果，转染后孵育24小时，随后使用LightSwitch荧光素酶检测试剂读取发光信号。
图1. PUNC和ARID3B人源3'UTR是let-7a微小RNA的靶标。 在存在let-7a微小RNA模拟物的情况下，PUNC和ARID3B基因的人源3'UTR报告基因信号显著降低，而管家基因和随机序列UTR的信号则未受影响。
讨论
我们已构建了一个全基因组范围的预克隆人3'非翻译区（3'UTR）报告基因载体文库，可用于在活细胞中研究miRNA与3'UTR的相互作用。本文展示了一种可重复且高通量的方法，利用荧光素酶报告系统共转染miRNA模拟物与3'UTR报告载体。
该方法依赖于研究人员使用一种高转染效率的细胞系，并通过过表达技术干扰miRNA活性。对于转染效率较低的细胞系，研究人员可考虑使用我们与Sigma公司合作开发的慢病毒3'非翻译区（3'UTR）报告基因文库（Mission 3'UTR Lenti GoClones）。用miRNA模拟物（mimics）处理细胞会产生类似过表达的实验条件；在进行此类研究时，研究人员必须考虑到，这种条件可能无法完全代表真实的生理状态。为解决过表达带来的问题，研究人员可同时使用miRNA抑制剂和模拟物，通过两种不同类型的干扰方式来研究其相互作用12-14。
一旦确定了可能的miRNA靶点，研究人员可能希望对推测的miRNA结合位点进行突变，以确定这些位点是否为功能相互作用所必需。他们还可能希望扩大实验规模，以检测数百个不同的潜在靶UTR（Boutz）。此外，如果研究人员希望探究miRNA是否影响转录本的稳定性或翻译效率，可将荧光素酶报告基因数据与稳态转录本水平的测量结果进行比较。任何未伴随转录本水平相应变化的荧光素酶信号变化，均提示其对翻译效率存在影响。最后，研究人员可利用报告载体构建剂量反应曲线，以比较不同UTR对miRNA浓度变化的相对敏感性14。
披露
作者是SwitchGear Genomics的员工，该公司生产本文中出现的工具和试剂。本文的制作由SwitchGear Genomics赞助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 白色组织培养板（96孔，实底） | VWR international | 82050-736 | |
| 透明组织培养板（96孔）带盖 | VWR international | 353072 | |
| LightSwitch 荧光素酶检测试剂 |  SwitchGear | LS010 | |
| DharmaFECT 双重转染试剂（0.75 mL） | Dharmacon | T-2010-02 | |
| 铝箔板密封膜 | E&K Scientific | T592100 | |
| 透气型板密封膜 | E&K Scientific | T896100-S | |
| 酶标仪（化学发光检测型） | Molecular Devices | SpectraMax L |
参考文献
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale. Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).
- Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).
- Baek, D., Villen, J., Shin, C. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance. PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Lall, S., Krek, A., Chen, K. A genome-wide map of conserved microRNA targets in. 16, 460-471 (2006).
- Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122. J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433, 769-773 (2005).
- Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).
- Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA. 10, 544-5450 (2004).
- Liao, J. M., Lu, H. Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p. J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).
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