固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

摘要

本文概述了一种简单且通用的手动肽拟态物合成方法，该方法仅需基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中轻松实现肽拟态物的合成。文中详细描述了由36个单体组成的两亲性肽拟态物的合成、纯化与表征过程，并阐述了其自组装形成高度有序纳米片的特性。

摘要

肽模拟物是一类新型的仿生性非天然序列特异性杂合聚合物，具有抗蛋白酶降解能力、显著的生物活性，并可折叠形成高级有序的纳米结构。在结构上与肽类似，肽模拟物为聚N-取代甘氨酸，其侧链连接于氮原子而非α-碳原子。由于合成简便且结构多样，可用于验证驱动分子设计的基本原理 从头合成 新型生物活性与纳米结构材料的设计与工程化

在此介绍一种简单的手动肽拟态物（peptoid）合成方案，可高效合成长链多肽拟态物（最长可达50聚体），产率优异。该方法仅需基本实验设备、常规操作技术（如液体转移、过滤）以及市售试剂，使肽拟态物成为众多研究人员可及的工具。肽拟态物骨架通过“单体-亚单体法”逐个单体延伸，该方法包含两步单体加成循环：酰化与取代。首先，溴乙酸经活化后 原位 使用N,N'-二异丙基碳二亚胺将树脂结合的仲胺酰化。随后，伯胺通过亲核取代溴化物引入侧链。该两步循环反复进行，直至达到目标链长。此两步循环的偶联效率通常超过98%，可实现长达50个残基的多肽类似物合成。由于可直接使用数百种易得的伯胺，亚单体法能够精确构建高度可调、序列精确且化学多样性丰富的多肽类似物。

由于具有合成灵活、结构稳定以及在原子水平上有序排列的特点，肽模拟物（peptoids）正逐渐成为纳米生物科学研究中一种多功能的仿生材料。最近，研究人员已成功实现了一种单链、两亲性且富含信息的聚肽模拟物折叠形成高度有序的纳米片层结构。该肽模拟物由36个单体组成，仅包含三种 commercially available 的单体：疏水性、阳离子性和阴离子性单体。其中，疏水性的苯乙基侧链埋藏在纳米片层的内部核心，而带电荷的氨基和羧基侧链则排列在亲水性的表面。这种肽模拟物纳米片层可作为膜模拟物、蛋白质模拟物、器件制备以及传感器的潜在平台。本文描述了肽模拟物的合成方法、片层形成过程及显微成像技术，为未来肽模拟物纳米片层的设计提供了简便可行的技术路径。

方案

1. 多肽拟物的固相单体亚单元合成

固相合成（SPS）是一种常用的技术，用于在惰性固相载体（如聚合物树脂珠）上逐步合成具有特定序列的生物大分子。SPS 的主要优势在于偶联产率高且易于去除过量反应物。在树脂上完成偶联反应后，只需简单排出过量试剂，并对树脂珠进行洗涤，即可准备进行下一步反应。在最终合成反应完成后，全长寡聚物从树脂上裂解下来，溶液中的产物可进一步研究。本文中，我们将 SPS 方法应用于制备具有特定序列的肽模拟物聚合物。

1. 装置准备：所有手动合成肽拟物的步骤均可在一次性聚丙烯（PP）烧结柱或配有三通活塞的烧结玻璃反应容器中进行。所有操作均需在通风橱内完成。在玻璃容器或塑料柱中进行反应孵育时，将其中一端连接至氮气源，使溶液缓慢鼓泡以实现充分混合。或者，对于一次性柱中的反应孵育，可用盖子密封柱的两端，并将其置于旋转摇床上。在排出反应混合物或洗涤液时，通过废液捕集瓶连接至实验室真空系统。反应容器应配备粗孔烧结板。为防止树脂珠粘附于玻璃容器内壁，需对玻璃反应容器进行硅烷化处理：配制5%（v/v）二氯二甲基硅烷的二氯乙烷溶液，将洁净干燥的反应容器加满该硅烷化溶液，静置30分钟，然后排干。依次用二氯乙烷（DCE）和甲醇各洗涤一次。硅烷化溶液可重复使用，应妥善保存。排干后可甩去多余溶液并在移除活塞后烘干玻璃器皿。在加入树脂前需冷却反应容器。
2. 向烧结反应容器中加入100 mg（0.06 mmol）Rink酰胺树脂。加入2 mL二甲基甲酰胺（DMF）使树脂溶胀，通过振荡或鼓泡混合10分钟。通过真空抽滤除去溶液，得到溶胀后的树脂。
3. 加入1 mL含20% 4-甲基哌啶的DMF溶液（v/v），以脱除Fmoc保护基。振荡2分钟，排液；再重复一次，孵育时间为12分钟。
4. 加入2 mL DMF，振荡15秒，排液，重复此洗涤步骤3次。
5. 溴乙酰化：加入1 mL DMF中的0.6 M溴乙酸溶液（0.6 mmol）及86 μL N,N'-二异丙基碳二亚胺（0.93当量，0.56 mmol）。在轻微鼓泡条件下孵育30分钟，排液后用2 mL DMF洗涤（重复4次）。
6. 取代反应：加入1 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中的1–2 M胺溶液。在鼓泡条件下孵育30–120分钟，排液后用DMF洗涤（每次2 mL，重复4次）。
7. 通过重复亚单体循环（即步骤1.5（溴乙酰化）和步骤1.6（取代反应））继续延长肽拟物链。

8. 最后一次取代反应完成后，用 2 mL DMF 洗涤（重复 4 次），再用 2 mL 二氯甲烷洗涤（重复 3 次）。盖紧并保存反应容器，直至进行裂解。
9. 合成暂停（可选）：若需在肽拟物合成过程中暂停，请完成当前的取代反应，然后继续执行步骤 1.8。若要继续延长肽拟物链，请通过重新溶胀干燥树脂（步骤 1.2）并重复亚单体循环（步骤 1.5 和 1.6）来重启合成。除第二次取代反应后外，每次取代反应后均可将树脂干燥并储存，因为树脂-肽拟物偶联物在第二次取代后可能发生环化生成二酮哌嗪副产物。
10. 对于多个并行合成反应，建议使用固相萃取真空装置以提高效率。肽拟物合成也可通过在商用多肽合成仪上正确编程方法实现自动化，例如 Aapptec Apex 396、CEM Liberty 微波合成仪和 Protein Technologies Inc. Prelude 合成仪。

2. 裂解与侧链去保护

1. 将所有干燥树脂转移至一个 20 mL 闪烁玻璃小瓶中。
2. 在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备，向闪烁玻璃小瓶中加入 4 mL 三氟乙酸（TFA）裂解混合液¹（例如 95% 水溶液 TFA，参见讨论部分），盖紧瓶盖。在室温下振荡 10 分钟至 2 小时（参见讨论部分）。
3. 通过一次性聚丙烯（PP）砂芯滤筒将树脂过滤，收集 TFA 裂解液至一个新的、预先称重的 20 mL 闪烁玻璃小瓶中。使用一次性聚丙烯移液管转移裂解液较为方便。
4. 加入 1 mL 新鲜裂解混合液冲洗树脂，以收集残留的肽拟物。重复此步骤两次。
5. 通过通入温和的氮气流或使用 Biotage V10 浓缩仪蒸发去除 TFA。
6. 将粗产物油状物重新溶解于 6 mL 乙腈/水（1:1, v/v）溶液中用于高效液相色谱（HPLC）纯化。冷冻后冻干。重复一次。
7. 记录粗产物的重量。将产物以干燥粉末形式储存于 -20 °C。
8. 裂解测试（可选）：可取树脂总量的 0.5% 进行小规模裂解测试，以快速确定合成肽拟物的纯度与分子量，并验证所选裂解条件是否合适。该测试对于监测合成进程尤为有用。

3. 多肽拟态物的表征与纯化

1. 通过分析型高效液相色谱（HPLC）、电喷雾液相质谱（LC-MS）和/或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），确定粗产物的纯度以及是否含有目标分子量。
2. 准备一个 ˜5-10 mg/mL 的干肽模拟物粉末水溶液，根据溶解度需要加入最少量的乙腈。用 0.45 μm 滤膜过滤粗肽模拟物产物的澄清溶液。 μm 注射器滤器去除灰尘和颗粒。
3. 分析型高效液相色谱和电喷雾液相色谱-质谱：制备 _˜ 20 μg/mL 粗肽拟物溶液。过滤 200 μ0.45 微米 μm 滤膜过滤并注射 20 μL.
4. MALDI：混合 1 μL 的 _˜20 mg/mL 肽模拟物，含1 μL 矩阵。点 1 μ将样品点在MALDI板上并使其自然风干。基质和采集模式取决于样品（图5）。
5. 采用反相制备型高效液相色谱纯化粗制肽拟物混合物。根据多肽拟物的疏水性选择洗脱梯度及色谱柱（C4 或 C18）。合并纯化后的组分，冷冻并冻干，得到疏松的白色粉末。记录最终产物的重量。
6. HCl盐的形成（可选）：将冻干粉末重新溶解于100 mM HCl（水溶液）中，可加入少量乙腈助溶。转移至预先称重的玻璃小瓶中。冷冻并重新冻干，重复2次。重新称重以确定肽模拟物粉末的质量。

4. 佩普托德纳米片的形成

本部分描述了由单链、序列特异性的两亲性36聚肽模拟物（图1）形成片层的实验方案。在按照上述方法合成、纯化并冻干肽模拟物后，将所得白色粉末溶解于DMSO中，配制成2 mM的储备溶液。

1. 在1 dram玻璃小瓶中，配制500 μL含20 μM peptoid的片层形成缓冲液（10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 8.0的水溶液）。首先加入445 μL Milli-Q水和50 μL 10倍浓度的片层形成缓冲液，涡旋混匀。然后加入5 μL 2 mM peptoid储备溶液，轻轻旋转混匀。盖紧玻璃小瓶。
2. 通过轻柔搅动稀释的peptoid水溶液可形成片层。将玻璃小瓶从水平位置缓慢倾斜至直立位置即可形成片层。轻微振荡也可形成片层，但所得片层通常较小且直边较少。片层形成机制的更详细分析将另文报道。²
3. 为获得大量高质量片层，将玻璃小瓶围绕水平轴缓慢旋转（<1 RPM），持续一至三天。可使用适当的Technical Resources RKVSD Rotamix旋转管架或定制的摇床连续完成此操作。
4. 纳米片透析（可选）：在某些应用中，可能需要去除游离的peptoid链或缓冲液/盐分。将Float-a-Lyzer 100 kD透析膜浸泡于所需缓冲液中15分钟。将500 μL peptoid片层溶液加入样品室中。将其浸入500 mL所需缓冲液中，以磁力搅拌子在60 rpm下搅拌。透析过程持续4小时，每小时更换一次新鲜缓冲液。

5. 纳米片的荧光显微镜观察

1. 使用 Nile Red 对纳米片进行荧光成像，Nile Red 是一种环境敏感型染料，当其定位于疏水环境时，荧光强度会增强（图 2）。
2. 向 100 μL 纳米片溶液中加入 1 μL 的 100 μM Nile Red，使 Nile Red 的终浓度达到 1 μM。
3. 用热水配制 1% 琼脂糖溶液，并倒入塑料培养皿中。确保琼脂糖溶液厚度约为 1/8 英寸，在平坦表面上静置冷却。琼脂糖凝固后，用刮铲切取 1 cm × 1 cm 的小方块并转移至载玻片上。
4. 为使纳米片保持在同一焦平面，将 1 μL 纳米片溶液滴加在琼脂糖小块上。静置 2 分钟，使琼脂糖吸收缓冲液，从而将纳米片保留在表面。应在 15 分钟内完成成像，否则琼脂糖会因脱水而发生形变。
5. 若需在溶液中对纳米片进行成像，可将 15 μL 样品加载至载玻片上直径为 20 mm、厚度为 0.12 mm 的垫片内，再盖上盖玻片。若仅将纳米片简单夹在载玻片与盖玻片之间而不使用垫片，则大量纳米片会发生剪切，且看似微小的蒸发作用会导致纳米片持续移动。
6. 在落射荧光照明下对纳米片进行成像（例如，使用配备 Texas red 滤光片的 Andor iXonEM+ EMCCD 光谱仪的 Olympus IX81 倒置显微镜）。

6. 纳米片的扫描电子显微镜（SEM）观察

1. 硅基底的等离子体刻蚀（可选）：对硅芯片进行等离子体刻蚀，以促进片层的吸附。将硅芯片放入等离子清洗机（例如 Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G）的真空腔室中。抽真空至 200 mTorr，并将射频线圈功率设为 18 W（PDC-32G 的高功率设置）。刻蚀 2 分钟。
2. 在经等离子处理的硅基底上滴加 20 μL 的多肽模拟物片层溶液。静置 3 分钟。用 Kim-wipe 纸尖端吸除多余溶液。再用移液枪滴加 20 μL 水至表面，再次吸除多余液体，以去除缓冲液和盐分。重复此步骤 4 次。
3. 或者，将多肽模拟物片层溶液对水进行透析，以去除缓冲液和盐分。在经等离子处理的硅基底上滴加 20 μL 透析后的片层溶液。让样品在空气中自然干燥。
4. 使用扫描电子显微镜（例如 Zeiss Gemini Ultra-55 Analytical Scanning Electron Microscope），配备镜内探测器，在 1 kV 至 5 kV 的电子束能量下对片层进行成像（图 3）。

7. 安全注意事项：

1. 二甲基甲酰胺和二氯甲烷被合理怀疑为致癌物。
2. N,N'-二异丙基碳二亚胺、4-甲基哌啶和溴乙酸对皮肤、眼睛和呼吸道有害，应在通风橱内谨慎使用。这些物质若被吸入或经皮肤吸收可能具有毒性，并可能导致过敏反应。空容器仍可能残留产品（液体/蒸气），在移出通风橱前应彻底冲洗。
3. 三氟乙酸（TFA）是一种强酸，对上呼吸道、眼睛和皮肤具有极强的腐蚀性。TFA 还具有高挥发性，应始终在通风橱内存放其浓溶液，以避免造成呼吸道损伤。操作 TFA 溶液时应使用适当的个人防护装备（PPE）并保持警惕。一旦手套接触 TFA，应立即更换，并迅速清理任何泄漏物。

8. 典型结果：

本部分描述了一种序列特异性的36聚肽模拟物链的合成、表征与纯化，该肽模拟物链可折叠形成高度有序的纳米片层³（图1）。

在100 mg Rink酰胺树脂上合成了嵌段电荷肽拟物H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂。所有取代反应均使用2 M胺溶液，第1-18位残基反应时间为60分钟，第19-36位残基反应时间为120分钟。t-丁基β-丙氨酸盐酸盐被转化为游离碱（见讨论部分），而苯乙胺和Boc-乙二胺则直接使用。树脂用95% TFA、2.5% 三异丙基硅烷、2.5% 水的混合液裂解2小时。蒸发除去TFA后，得到约180 mg粘稠油状物，将其重新溶解于6 mL乙腈:水（1:1, v/v）混合溶液中。通过分析型RP-HPLC（C18，5 μm，50 × 2 mm色谱柱，60 °C，流速1 mL/min，运行30分钟，流动相为含0.1% (v/v) TFA的水-乙腈梯度，乙腈比例从30%升至80%）和MALDI（图5）确认产物纯度（图4）及目标分子量的存在。

使用Vydac C18柱（10）进行反相高效液相色谱纯化 μm，22 mm × 250 mm）进行，流动相为含0.1% TFA的水-乙腈梯度（30%-60%），流速10 mL/min，运行60分钟。每次色谱运行上样量为60 mg粗产物。根据分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果（图4）合并纯度相近的馏分，冻干后得到产物 _˜80 mg 的絮状白色粉末。

通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）确认纯化的嵌段电荷肽模拟物的分子量。取1 μL浓度为100 μM的纯化肽模拟物（溶于乙腈:水1:1（v/v）溶液中），与1 μL基质溶液（5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于乙腈:水1:1（v/v）溶液中，含0.1%三氟乙酸）混合，取1 μL混合液点样于MALDI靶板上。待样品自然风干后，将其置于Applied Biosystem/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF分析仪中检测。采集与处理模式设置为线性低分子量模式。将计算所得分子量输入目标质量，以自动调整延迟时间。激光强度设定为3400。实测分子量为4981.2，与理论计算值4981.74高度一致。

将冻干纯化粉末溶于DMSO中，配制成2 mM的储备液，可在4 °C下保存。按照前述方案制备片层，并通过荧光光学显微镜和扫描电镜（SEM）进行成像（图2和图3）。观察到多种形状，其特征尺寸最大可达300 μm，且具有明显的直边结构。

图1. 嵌段电荷肽模拟物 H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂ 的序列。一种单链、嵌段电荷、两亲性36聚肽模拟物可自组装形成高度有序的二维纳米片³。其计算分子量为4981.74。

图2. 肽模拟物纳米片的荧光显微镜图像。纳米片由含10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0的20 μM肽模拟物溶液形成。纳米片在含有1 μM Nile Red的琼脂糖上成像。比例尺为100 μm。

图3. 肽模拟物纳米片的扫描电子显微镜图像。纳米片由20 μM 肽模拟物溶液在10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0条件下形成。比例尺为5 μm。

图4. H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂的分析性反相高效液相色谱图。图中显示了粗产物及纯化后产物的分析性高效液相色谱图（色谱条件：C18柱，5 μm，50 x 2 mm，流动相梯度30-80%，流速1 mL/min，运行时间30分钟，柱温60°C），该产物为分段电荷肽类似物H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂。

图5. H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂ 的 MALDI-TOF 质谱图。实测质量为 4981.2，与计算质量 4981.74 非常接近。

讨论

应用与意义

本方案描述了一种简单且高效的肽素合成方法，以及肽素在水相中自组装形成纳米片的过程。大多数实验室均可轻松开展肽素的合成，因为该过程仅需使用廉价的材料、基本的专业知识和简便的技术⁴。同样，超薄且高度有序的纳米片的自组装也仅需反复倾斜装有稀释肽素水溶液的小瓶即可实现²。肽素是生物医学和纳米科学研究中极具前景的材料，因其结构稳定、合成灵活，同时具有序列特异性和高度可调性⁵。已有研究表明，肽素具备生物活性（如治疗剂^6,7、诊断工具⁸、细胞内递送^9-10），并可折叠形成层级化的纳米结构^{3, 11-14}。由于其模块化合成特性，可快速构建组合肽素文库^15-19，并用于广泛的功能或性质筛选。特别是这些纳米片，可作为二维展示支架、膜模拟物、生物传感器、蛋白质模拟物以及器件制备的潜在平台。鉴于可能的序列种类几乎无穷无尽，肽素研究领域正在迅速扩展。

多肽拟态物固相亚单体合成中的变量

由于能够从数量庞大且种类多样的单体库中进行选择²⁰，在某些情况下，为了提高每一步的偶联效率从而提升最终产物的产率，需要对亚单体法进行适当的调整。引入未保护的杂环侧链时，需使用氯乙酸代替溴乙酸²¹。对于较长的肽拟物序列或亲核性较低的胺类，通常在进行约20次偶联后，需延长取代反应时间并提高胺的浓度。通过使用水浴控温的反应容器将反应体系加热至35 °C，有助于促进反应进行。对于异丙胺等高挥发性的胺类，必须注意避免其挥发损失。

以盐酸盐形式存在的胺类，例如叔丁基-β-丙氨酸盐酸盐，在用于取代反应前需先游离为游离碱。该过程可通过将胺类溶解或悬浮于二氯甲烷（DCM）中实现˜5 g 胺/25 mL 二氯甲烷），并在分液漏斗中用等摩尔浓度的氢氧化钠水溶液中和。收集二氯甲烷层，并用额外的二氯甲烷洗涤水层。合并的二氯甲烷层经硫酸钠干燥后过滤至预先称重的圆底烧瓶中。通过旋转蒸发除去溶剂，得到油状产物，称重并记录产物质量。

在裂解步骤中，TFA裂解试剂混合物及裂解时间取决于所用保护基的种类和数量。裂解试剂混合物的使用原则与传统的多肽去保护裂解方法类似¹。通常情况下，对于不含保护基或仅含少量对酸高度敏感的保护基（如BOC、三苯甲基）的序列，需孵育10分钟。对于含有较难去除的保护基（如叔丁酯、Mtr、Pbf）或含有多个保护基的序列，建议孵育2小时，以确保每条链完全去保护。粗品肽类似物通常可溶于乙腈:水 1:1（v/v）溶液中，但对于侧链整体疏水性较高的肽类似物，常需使用更高比例的乙腈。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基甲酰胺	EMD Millipore	EM-DX1726P-1	99+%
N-甲基吡咯烷酮	VWR	BDH1141-4LP	99%
溴乙酸	Acros Organics	200000-106	99%
4-甲基哌啶	Sigma-Aldrich	M73206	96%
N,N’-二异丙基碳二亚胺	Chem-Impex International	001100	99.5%
二氯甲烷	EMD Millipore	EMD-DX0835	ACS 级
乙腈	EMD Millipore	EM-AX0145P-1	99.8%
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508	99%
三异丙基硅烷	Sigma-Aldrich	233781-10G	用于 TFA 裂解
1,2-二氯–乙烷	JT Baker	JTH076-33	用于玻璃反应容器的硅烷化处理
苯乙胺	Sigma-Aldrich	407267-100ML	>99.5% 疏水性侧链胺
Boc-乙二胺	CNH Technologies	C-1112	阳离子型侧链胺
叔丁基-β-丙氨酸盐酸盐	Chem-Impex International	04407	阴离子型侧链胺
α-氰基-4-羟基肉桂酸	Sigma-Aldrich	C8982-10X10MG	用于 MALDI 基质
尼罗红	Sigma-Aldrich	19123-10MG	用于荧光成像
二氯二甲基硅烷	Sigma-Aldrich	80430-500G-F	用于玻璃反应容器的硅烷化处理
一次性聚丙烯烧结柱	Applied Separations	2416	6 mL 聚丙烯柱，配有 20 mm 聚乙烯烧结片
一次性三通鲁尔接头	Cole-Parmer	31200-80	用于一次性手动合成反应容器的旋塞阀
鲁尔锁环	Cole-Parmer	45503-19	1/4" 接头，用于一次性手动合成反应容器
鲁尔接头	Cole-Parmer	45500-20	1/4" 接头，用于一次性手动合成反应容器
一次性聚丙烯移液管	VWR international	16001-194	用于 TFA 转移
鲁尔锁塑料注射器	National Scientific	S7515-5	6 mL 注射器
1 液量盎司玻璃小瓶	VWR international	66011-041	配有酚醛模制螺旋盖和聚乙烯覆面纸浆衬垫
20 mL 闪烁瓶	VWR international	66022-060	配有聚丙烯盖和纸浆箔衬垫
Secure-Seal 粘合垫片	Invitrogen	S-24736	用于荧光成像
载玻片	Electron Microscopy Sciences	63411	用于荧光成像
盖玻片	VWR international	48366-067	用于荧光成像
4” 硅晶圆	Ted Pella, Inc.	16007	预先切割为 5×7 mm 芯片
0.45 滤膜	VWR international	28143-924	用于 HPLC。 PTFE 膜
琼脂糖	BD Biosciences	212272	用于荧光成像
SPE 真空萃取装置	Sigma-Aldrich	57044	SPE 真空萃取装置示例
烧结玻璃容器	Ace glass	6402-12	孔隙度 C 烧结片
等离子清洗/灭菌仪	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G	用于 SEM 前处理硅芯片的等离子清洗仪示例