白色念珠菌阴道炎实验小鼠模型中阴道接种与样本采集的实验方案

摘要

本文描述了在实验动物模型中评估Candida性阴道炎的关键技术。这些方法可实现阴道标本及引流腰淋巴结中淋巴细胞的快速采集。这些技术有望用于建立其他女性下生殖道疾病的鼠类模型。

摘要

外阴阴道念珠菌病（VVC）是由念珠菌属（Candida）引起的一种女性下生殖道真菌感染，在生育年龄的健康女性中约有75%曾受其影响^18,32-34。易感因素包括使用抗生素、血糖控制不佳的糖尿病，以及因妊娠、口服避孕药或激素替代治疗导致的生殖激素水平变化^33,34。复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）定义为每年发作三次或以上，影响约5%至8%无明显易感因素的女性³³。

一种阴道念珠菌病（VVC）的小鼠实验模型已被建立，用于研究其发病机制及黏膜宿主免疫应答 假丝酵母^{3,4,11,16,17,19,21,25,37}该模型还被用于测试潜在的抗真菌疗法 体内^13,24. 该模型要求将动物维持在假性动情期状态以达到最佳效果 假丝酵母 定植/感染^6,14,23在这些条件下，接种的动物将可检测到持续数周至数月的阴道真菌负荷。以往研究表明，该动物模型在免疫学和生理学特性方面与人类感染具有极高的相似性。^3,16,21。然而，差异包括缺乏 假丝酵母 作为小鼠正常的阴道菌群和中性阴道pH。

本文展示了一系列小鼠阴道炎模型中的关键方法，包括阴道接种、阴道样本的快速采集、阴道真菌负荷的评估，以及用于细胞提取/分离的组织制备。随后提供了阴道灌洗液成分、真菌负荷以及引流淋巴结白细胞收获量的代表性结果。通过使用麻醉剂，可在同一只小鼠上于多个时间点采集灌洗样本，从而实现对感染/定植过程的纵向评估。此外，该模型无需使用免疫抑制剂即可建立感染，从而可在明确的宿主条件下开展免疫学研究。最后，本模型及其中介绍的每种技术有望被用于研究女性下生殖道的其他感染性疾病（如细菌性、寄生虫性和病毒性感染）及其相应的局部或全身性宿主防御机制。

方案

1. 阴道接种 白色念珠菌

1. 接种前3天，将动物固定以暴露腹部，在下腹部皮下注射100 μl含有0.1–0.5 mg β-雌二醇的芝麻油。进针时应位于皮肤侧方约5至10 mm处，以尽量减少注射部位的液体渗漏。
   在此模型中，下腹部皮下给予雌激素效果最佳，因其靠近生殖道。有效剂量可能因小鼠品系、年龄或雌激素衍生物的不同而有所差异。既往研究中，使用6–8周龄的CBA-J (H-2^κ)、C3H/HeN (H-2^κ)、C57BL/6 (H-2^b)、Balb/c (H-2^d)、DBA/2 (H-2^d) 和 SJL (H-2^s) 小鼠时，0.1 mg/100 μl剂量已被证实有效，表现为阴道壁增厚、阴道黏液减少以及上皮细胞脱落增加。使用该浓度雌激素处理的小鼠可实现稳定的阴道Candida定植。对于其他品系或年龄的小鼠接种，建议先进行预实验，以确认在此修改条件下雌激素的有效性，并在必要时增加雌激素剂量。
   雌激素溶液应于注射当天每次新鲜配制。为确保雌激素在芝麻油中完全溶解，需使用涡旋振荡器充分混匀，并间歇性地在37°C下加热。在整个研究期间，应每周重复注射一次。
2. 制备接种物时，从沙....

讨论

一种实验性小鼠模型 假丝酵母 阴道炎模型已在过去几十年中建立并用于研究黏膜宿主对病原体的免疫应答 假丝酵母 以及用于测试抗真菌疗法^{3,4,11,13,16,17,19,21,24,25,37}. 此处介绍的方案采用了高效且劳动强度较低的方法，似乎是目前最优化的模型系统之一 假丝酵母 迄今为止所描述的阴道炎。这些技术能够快速定量真菌负荷并采集阴道样本。此外，先前的研究对多种单倍型小鼠品系（n=13）在接种后不同时间点进行检测，结果显示在真菌负荷及宿主对阴道定植的反应方面具有相似程度的变异性。 假丝酵母^2,6,41因此，该模型可不受小鼠品系或感染时间限制地整合到现有实验方案中。然而，需注意的是，即使接种相同剂量的真菌，不同动物间的阴道真菌载量仍可能存在较大差异（图6B）。有证据表明，这种差异源于真菌在阴道上皮早期黏附程度的不同。⁴¹因此，出于统计学考虑，建议每组使用7-10只小鼠。

不同菌株之间阴道真菌载量的差异也已有证据表明 C. albi.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雌性 CBA/J 小鼠	Charles River Laboratories	01C38	5–6 周龄
Candida albicans (3153A)	英国病原真菌国家保藏中心	NCPF3153
芝麻油	Sigma-Aldrich	S3547	D–s 使用前无需预先灭菌
Β-雌二醇-17-戊酸酯	Sigma-Aldrich	E1631	芝麻油中浓度为 0.1–0.5 mg
植物蛋白胨	BD Biosciences	211906	添加 0.1% 葡萄糖作为补充
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154
沙保葡萄糖琼脂	BD Biosciences	211584
IV 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138	0.25%
中性蛋白酶	Invitrogen	17105-041	1.7 U/mL
金属网筛	TWP	060X060S0065W36T	60 目，不锈钢
Hanks’ 平衡盐溶液	Invitrogen	24020-117
CytoPrep 固定液	Fisher Scientific	12-570-10	用于保存涂片
巴氏染色液 EA-65	EMD Millipore	7054X-85
巴氏染色液 OG-6	EMD Millipore	7052X-85
Harris’ 苏木精铝染液	EMD Millipore	638A-85
异氟烷	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60	需配合异氟烷挥发器或密闭式滴加麻醉装置使用