我们介绍了全氟十氢化萘作为浸润性封片介质的使用方法。这是一种简单的方法，可最大限度地减少生理影响，从而改善拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片组织的成像深度。
本文内容
摘要
摘要
在生物样品深层获取高分辨率图像的问题已被广泛认知1。在充满空气的组织中，例如植物叶片的海绵状叶肉或脊椎动物的肺部，由于细胞组分之间、细胞与气腔之间以及生物组织与光学系统其余部分之间的折射率多次变化，进一步增加了成像难度。此外，折射率不匹配会导致荧光显微镜中荧光团激发和信号发射的衰减。本文介绍了全氟碳化合物——全氟十氢萘（PFD）作为一种渗透性成像介质的应用，它可在不增加具有破坏性的激光功率的前提下，显著改善激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）在深层组织中的样品成像效果，且对生理状态影响极小2。我们描述了将PFD用于Arabidopsis thaliana叶片组织的实验方案，该组织因其结构复杂而具有挑战性的光学特性（图1）。PFD具备多种适合此用途的特性3。其折射率（1.313）与水（1.333）相近，且比空气（1.000）更接近细胞质（约1.4）。此外，PFD易于获得、无自发荧光且无毒性。PFD的表面张力较低（19 dynes cm-1），低于水（72 dynes cm-1），也低于气孔渗透的临界值（25–30 dyne cm-1）4，因此可在无需施加可能造成损伤的真空或表面活性剂的情况下，充分浸润海绵状叶肉的气腔。最后但至关重要的是，PFD具有极强的溶解CO2和O2的能力，可在组织被浸润后维持气体交换，从而最大限度地减少对样品生理状态的影响。这些特性已被应用于多种领域，包括部分液体呼吸和肺部膨胀5,6、外科手术7、人工血液8、培养基的氧合9以及植物中冰晶形成的研究10。目前，活体共聚焦成像通常将组织置于水中或水性缓冲液中。我们认为，使用PFD作为封片介质是对现有方法的改进，可实现活体完整叶片样品的简便制备与成像。
方案
以下方案描述了一种使用PFD作为浸润性封片介质对Arabidopsis thaliana叶片进行处理的简单方法，但我们预计该方法也可应用于多种需要对富含空气组织进行成像的实验场景。
1. 在 PFD 中固定叶片样品
- 准备一个带有透气性垫圈的显微镜载玻片，垫圈材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS，Carolina Observation Gel）。PDMS 是一种粘弹性聚合物，可塑造成符合实验需求的腔室结构。
- 将全氟化碳液体（PFD）与空气平衡。可通过向液体中通入空气或在装有空气的瓶中振荡少量 PFD 实现此步骤。
- 将 PFD 倒入敞口培养皿中，并将整株幼苗或离体叶片漂浮于 PFD 表面 5 分钟。组织将变得半透明，类似于玻璃化组织（图 2 (a)）。由于光照条件及所用组织年龄的不同，叶片颜色可能比接触 PFD 前更深或更浅。
- 用已与空气平衡的 PFD 填充 PDMS 腔室，并小心地将孵育培养皿中的组织样本转移至 PDMS 腔室内。用盖玻片密封载玻片，并根据实验要求进行成像。
- 注意：PFD 在构建于盖玻片上的开放式腔室或灌流腔室中同样表现良好，且可与硅脂兼容。PFD 与聚四氟乙烯（Teflon）组件不兼容，因其会溶解此类材料。
2. 代表性结果：
对经PFD孵育的叶片样品进行显微观察显示，大部分气腔已被充满。图2（b）展示了充满悬浮于PFD中的重组GFP的气腔。显然，在PFD中孵育后叶片内部被充分填充，但偶尔仍可能存在少量残留气泡。在这些条件下，水无法完全填充叶片。共聚焦激光扫描显微镜（LSCM）对在空气、水或PFD中孵育并封片的样品进行成像的结果表明，PFD在成像深度方面优于空气和水（图3）。图3所示示例为在空气、水和PFD中封片的拟南芥（Arabidopsis）叶片，其表达细胞质定位的Venus蛋白——一种在35S启动子驱动下组成型表达的YFP变体11。比较PFD与水的成像结果可见，使用PFD时成像深度大约提高了2倍。然而需要注意的是，使用PFD所获得的具体改善程度会因物镜的数值孔径和所用组织类型而异。我们已在PFD处理的幼苗中观察到胞质环流和根毛伸长现象，二者均为植物健康状态的指标。此外，我们已证实2，在成像所用的时间尺度内，反映植物光合作用功能的指标Fv/Fm12仍保持在可接受范围内。
图1. 植物叶片结构复杂性及其光学意义
示意图展示拟南芥（A. thaliana）叶片的解剖结构及其与光学装置的关系。图中缩写包括：obj. = 物镜，imm. = 浸油，cov. = 盖玻片，mnt. = 封片剂，cut. = 角质层，ad. ep. = 近轴表皮，st. = 气孔，sp. = 海绵组织，a.s. = 气室，pal. = 栅栏组织，v.b. = 维管束，ad. ep. = 近轴表皮。细胞壁以黑色线条表示。
图2. PFD 可轻易穿透 拟南芥 叶片
（a）叶片分别在空气、水或PFD中孵育5分钟，使用Leica DCF3000FX数码相机配合Leica MZ16F显微镜（Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK）进行成像。JoVE标志打印在醋酸纤维膜上，并由下方光源箱照明。曝光时间为89 ms，所有图像均以相同条件采集和处理。比例尺表示2 mm。
（b）携带纯化重组绿色荧光蛋白（GFP）的PFD界定气腔 体内GFP 以绿色伪彩显示，红色用于显示叶绿素的自发荧光，从而界定叶肉细胞。图2(b) 经Littlejohn许可复制，完整技术细节可获取 等 20102。比例尺代表 25 m。
图3. PFD改善叶片的共聚焦成像
LSCM图像显示完整拟南芥（A. thaliana）叶片中细胞质定位的Venus荧光（绿色）和叶绿素自发荧光（红色），叶片分别在空气、水或PFD中成像。激发波长为514 nm，Venus的荧光发射记录范围为518–604 nm，叶绿体为657–679 nm。每个图版均为从Z轴堆栈的11个共聚焦图像（以5 μm间隔采集）中提取的单个共聚焦切片。这些图像来自一个完整的Z轴堆栈（共59个图像，以1 μm间隔采集），该完整堆栈用于生成补充视频。深度测量值均相对于表皮表面给出。图中展示的是经过相同方式处理的代表性图像。显微镜设置等实验细节与Littlejohn et al., 20102中所述完全相同。比例尺为20 μm。
讨论
这是一种简单且易于使用的成像技术，可改善对充气组织或光学结构复杂组织的显微观察。我们已证明该技术具有若干显著优势，希望其能被用于解答与富含空气的组织相关的生物学问题。例如，该技术非常适合用于研究病原体对植物叶肉组织或肺部的侵袭过程。同时，我们也认识到该技术存在一定的局限性。目前我们正在改进折射率匹配效果、拓展其在其他显微成像模式中的应用，并尝试在长时间实验过程中实现全氟碳化合物封片剂的补充。此外，我们也意识到全氟碳化合物（PFCs）的一个主要优点——即生物学惰性——也存在另一面。由于PFCs不易溶解生物分子，因此也难以用于递送感兴趣的化合物，如激素、药物以及其他小分子或离子。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢埃克塞特大学的 Nicholas Smirnoff 教授提供的建议以及埃克塞特大学生物成像中心的支持。本研究由英国生物技术和生物科学研究理事会（资助编号 BB/E002682/1）提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全氟十氢萘 | F2 Chemicals | N/A | 电话订购。 |
| 卡罗来纳观察凝胶 | Blades Biological | 13-2700 |
参考文献
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