通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

摘要

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。

摘要

子宫内膜异位症是一种病因尚不明确的慢性疼痛性疾病。此外，子宫内膜异位症的治疗可能需要通过腹腔镜手术切除病灶，和/或长期使用药物控制疼痛和不孕等症状。据估计，子宫内膜异位症在美国每年造成的经济损失高达220亿美元¹。为了进一步了解这一神秘疾病的发病机制，研究人员已采用多种动物模型进行研究。灵长类动物可自发形成子宫内膜异位症，因此灵长类模型最接近人类女性的疾病表现。然而，啮齿类动物模型成本更低且更易于获得²。本文所描述的模型涉及将子宫组织自体移植至肠系膜（图1），该模型最初在大鼠中建立³，随后被应用于小鼠⁴。这种自体移植的手术诱导型啮齿类模型旨在模拟女性子宫内膜异位症。我们及其他研究者此前已证实，小鼠或大鼠异位病灶中观察到的基因表达改变模式与患有该病的女性相似^5,6。在小鼠中进行手术的一个优势在于，目前有大量转基因小鼠品系可供使用，有助于研究人员确定特定分子成分在子宫内膜异位症发生和生长过程中的作用。另一种广泛应用的模型是将切除的人子宫内膜片段移植至免疫缺陷小鼠的腹膜腔，但该模型受限于缺乏正常免疫系统，而免疫系统被认为在子宫内膜异位症中具有重要作用^2,7。重要的是，手术诱导的小鼠子宫内膜异位症模型具有高度可塑性，已被广泛用于研究免疫系统⁸、激素^9,10和环境因素^11,12对子宫内膜异位症的影响，以及子宫内膜异位症对生育能力¹³和疼痛¹⁴的作用。

方案

1. 活体动物手术的规划

1. 确保已获得使用实验动物的适当批准。
2. 订购小鼠，并使其在新环境中至少适应一周时间。
3. 在未接触雄性信息素的情况下饲养的雌性小鼠可能会停止动情周期，这一现象称为惠滕效应（Whitten effect）^15,16。为维持小鼠动情周期，每隔五天将沾有雄鼠尿液的垫料转移至雌鼠笼中。或者，若使用开放式笼具，可将雌鼠笼置于两个雄鼠笼之间，以维持雌鼠规律的动情周期。
4. 在手术前至少一周每日进行阴道细胞学分析，以确认小鼠处于动情周期中（表1）¹⁷。
   1. 使用蜡笔在玻璃载玻片上划分八个区域，以便同时收集多只小鼠的阴道涂片。
   2. 用滴管将0.2–0.25 mL生理盐水或蒸馏水冲洗阴道。注意将滴管仅置于阴道口处，避免滴管刺激宫颈，否则可能引起假孕。将阴道灌洗液置于载玻片上，用于细胞类型的分析。载玻片可直接新鲜（湿片）观察，也可采用多种方法固定后，使用普通光学显微镜进行检查¹⁷。
5. 收集、清洁并灭菌所有必要的手术器械，以确保无菌手术顺利进行（参见材料部分）¹⁸。
6. 采用无菌技术配制PBS中的布托啡诺（buprenorphine）溶液，以提供0.2 mg/kg的终剂量。假设成年C57BL/6小鼠平均体重约为0.025 kg，每只小鼠皮下注射体积为0.15 ml，则布托....

讨论

在小鼠子宫内膜异位症手术诱导过程中，有几个关键参数需要注意。首先，子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，因此该手术应在保留卵巢的动物中进行，或在切除卵巢后补充雌激素的动物中进行²⁰。其次，将子宫内膜组织活检样本缝合至肠系膜动脉级联结构时必须极为谨慎。我们发现，仅使用两个相对宽松的结，每个结打一个结扣，即可固定组织样本，同时避免肠壁血供被结扎，从而防止组织坏死和动物死亡。我们强烈建议在正式实验前先在多只小鼠上进行练习，以确保缝合牢固、组织不会脱落，但又不会过紧而导致肠管坏死。第三，手术过程中必须使用含有青霉素和链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）保持肠组织湿润。第四，应尽量确保子宫内膜异位病灶的大小一致；为此，我们采用直径2 mm的活检打孔器，从切除的子宫组织中制备大小均一的子宫内膜异位植入物。

可根据研究人员的具体需求和科学问题，对本实验方案进行若干修改。一种可能的修改涉及动物的激素状况。子宫内膜异位病灶、残留完整子宫角以及免疫系统中的基因和蛋白表达，可能直接受到采集时间相对于动情周期阶段的影响。有多种方法可用于控制采集时的动情周期阶段，每种方法各有优缺点。例.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石蜡笔	Fisher Scientific	NC9954135
载玻片	Fisher Scientific	12-550-433
滴管	Fisher Scientific	S79383
用于评估阴道细胞学涂片的标准光学显微镜
盐酸丁丙诺啡 c3 (CARJET) 10×1 ml	巴特勒动物健康供应公司	022891
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	14040-117
10,000 U/ml 青霉素，10,000μg/ml 链霉素溶于 0.85% NaCl	Hyclone	SV30010
异氟烷	雅培实验室	05260-05
异氟烷非重复呼吸麻醉系统
循环热水加热垫
30 ml 注射器套管	Fisher Scientific	14-823-16G
无粉无菌手套	Fisher Scientific	19020558
眼用软膏	主要制药公司	10033691
小型电剪	Wahl Clipper Corp.	9861-600
氯己定擦洗	Fisher Scientific	NC9863042
70% 乙醇
多边形无菌区域	布塞医院一次性用品	696
3号手术刀	Fisher Scientific	22-079-657
10号手术刀片	Fisher Scientific	22-079-681
小型手术剪	Roboz外科器械公司	RS-5850
小型锯齿状半弯镊	Roboz 外科手术器械公司	RS-5135
5-0黑色编织丝线缝合线	Ethicon Inc.	K870H
无菌Pyrex玻璃培养皿	康宁	70160-101
2 mm 活检打孔器	Miltex Inc.	33-31
无菌纱布	Kendall	1806
6-0 黑色单丝乙希纶尼龙缝线	Ethicon Inc.	697G
持针器（可选）	World Precision Instruments, Inc.	500023
5-0 未染色编织涂层薇乔缝线	Ethicon Inc.	J490G
9毫米自动夹伤口夹	BD 生物科学	427631
自动缝合器 &和去除剂	BD 生物科学	427630
23G针头	BD 生物科学	305193
1 cc 注射器	BD 生物科学	301025
5倍放大镜支架（可选）	Fisher Scientific	14-648-23
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	SF100-4
游标卡尺	Roboz外科器械公司	RS-6466
包埋盒处理/包埋	Fisher Scientific	15-197-700A
活检泡沫垫	Fisher Scientific	22-038-222
RNAqueous RNA 提取试剂盒	Ambion	AM1912
液氮
带卡扣盖的微量离心平顶管	Fisher Scientific	02-681-240
氯胺酮（可选）	Sigma-Aldrich	K4138
右美托咪定盐酸盐（Domitor，可选）	Tocris Bioscience	2023
安替咪唑（可选）	Sigma-Aldrich	A9611