通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

摘要

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。

摘要

子宫内膜异位症是一种病因尚不明确的慢性疼痛性疾病。此外，子宫内膜异位症的治疗可能需要通过腹腔镜手术切除病灶，和/或长期使用药物控制疼痛和不孕等症状。据估计，子宫内膜异位症在美国每年造成的经济损失高达220亿美元¹。为了进一步了解这一神秘疾病的发病机制，研究人员已采用多种动物模型进行研究。灵长类动物可自发形成子宫内膜异位症，因此灵长类模型最接近人类女性的疾病表现。然而，啮齿类动物模型成本更低且更易于获得²。本文所描述的模型涉及将子宫组织自体移植至肠系膜（图1），该模型最初在大鼠中建立³，随后被应用于小鼠⁴。这种自体移植的手术诱导型啮齿类模型旨在模拟女性子宫内膜异位症。我们及其他研究者此前已证实，小鼠或大鼠异位病灶中观察到的基因表达改变模式与患有该病的女性相似^5,6。在小鼠中进行手术的一个优势在于，目前有大量转基因小鼠品系可供使用，有助于研究人员确定特定分子成分在子宫内膜异位症发生和生长过程中的作用。另一种广泛应用的模型是将切除的人子宫内膜片段移植至免疫缺陷小鼠的腹膜腔，但该模型受限于缺乏正常免疫系统，而免疫系统被认为在子宫内膜异位症中具有重要作用^2,7。重要的是，手术诱导的小鼠子宫内膜异位症模型具有高度可塑性，已被广泛用于研究免疫系统⁸、激素^9,10和环境因素^11,12对子宫内膜异位症的影响，以及子宫内膜异位症对生育能力¹³和疼痛¹⁴的作用。

方案

1. 活体动物手术的规划

1. 确保已获得使用实验动物的适当批准。
2. 订购小鼠，并使其在新环境中至少适应一周时间。
3. 在未接触雄性信息素的情况下饲养的雌性小鼠可能会停止动情周期，这一现象称为惠滕效应（Whitten effect）^15,16。为维持小鼠动情周期，每隔五天将沾有雄鼠尿液的垫料转移至雌鼠笼中。或者，若使用开放式笼具，可将雌鼠笼置于两个雄鼠笼之间，以维持雌鼠规律的动情周期。
4. 在手术前至少一周每日进行阴道细胞学分析，以确认小鼠处于动情周期中（表1）¹⁷。
   1. 使用蜡笔在玻璃载玻片上划分八个区域，以便同时收集多只小鼠的阴道涂片。
   2. 用滴管将0.2–0.25 mL生理盐水或蒸馏水冲洗阴道。注意将滴管仅置于阴道口处，避免滴管刺激宫颈，否则可能引起假孕。将阴道灌洗液置于载玻片上，用于细胞类型的分析。载玻片可直接新鲜（湿片）观察，也可采用多种方法固定后，使用普通光学显微镜进行检查¹⁷。
5. 收集、清洁并灭菌所有必要的手术器械，以确保无菌手术顺利进行（参见材料部分）¹⁸。
6. 采用无菌技术配制PBS中的布托啡诺（buprenorphine）溶液，以提供0.2 mg/kg的终剂量。假设成年C57BL/6小鼠平均体重约为0.025 kg，每只小鼠皮下注射体积为0.15 ml，则布托啡诺溶液浓度应为0.0333 mg/ml。布托啡诺可预先配制，并分装保存。请注意，布托啡诺为受控物质（III类管制药品），需持有DEA许可证并进行详细的库存记录。
7. 配制含青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的无菌PBS溶液。
8. 在诱导前72小时，将沾有雄鼠尿液的垫料转移至雌鼠笼中，以同步动情周期¹⁵。

2. 准备活体动物手术区域

1. 按照先前所述方法准备手术区域¹⁸。
2. 准备操作区域，摆放电动剪毛器、眼科软膏和外科洗手液。
3. 通过在手术区域放置循环热水加热垫来维持手术期间动物的体温。在循环热水加热垫上覆盖一层无菌防水垫。在无菌手术区域内摆放手术器械、缝线、无菌玻璃培养皿、活检打孔器、无菌纱布、伤口夹和伤口夹施加器。
4. 准备恢复区域，将循环热水加热垫一半置于空鼠笼下方，以便小鼠在需要时可自行远离热源。

3. 麻醉小鼠并进行手术准备

1. 记录小鼠体重，并通过评估阴道细胞学确定其动情周期阶段。
2. 进行麻醉诱导时，将小鼠放入一个空的麻醉室（带实心盖的空笼子，盖上设有异氟烷输入口）。开启异氟烷非重复呼吸麻醉系统，并将蒸发器设定为4%异氟烷（氧气流速为0.5至1 L/min）。
3. 当小鼠进入麻醉状态后，将异氟烷气流切换至鼻锥（30–60 ml注射器套管），并将小鼠的鼻和口置于准备台上的鼻锥中。手术剩余过程中可通过较低浓度的异氟烷维持充分麻醉（约2.5–3.5%异氟烷）。麻醉深度应通过脚趾夹捏刺激无反应来判断。
4. 涂抹眼用软膏，以防止手术期间眼睛干燥。
5. 使用小型电动剪毛器剃除手术区域的毛发。
6. 用氯己定清洗液和70%乙醇交替擦拭三次，对手术部位进行消毒和准备。
7. 用无菌巾覆盖动物，建立无菌术野。

4. 子宫结扎

1. 使用小剪刀或手术刀片，在阴道开口前方0.5–1.0 cm处做一长约~1 cm的正中切口。
2. 将闭合的剪刀从切口插入，使刀片位于体壁与腹壁之间。通过缓慢开合剪刀，钝性分离切口周围区域，使腹壁与皮肤充分分离。切口周围若仍有可见的粘连组织，可小心剪断。若未充分进行钝性分离，将增加后续关闭腹壁的难度。
3. 使用小镊子轻柔地定位左侧子宫角。子宫位于肠管背侧，初进入切口时所见即为肠管。在某些情况下，可先定位卵巢及其相连的卵巢脂肪垫。轻柔提起子宫角，并在其下方滑入一把张开的镊子作为牵开器。如需，可在此时观察卵巢和子宫的外观，以获取有关诱导时动情周期阶段的额外信息（见表1）。
4. 将两段6–8 cm长的5-0黑色编织丝线（不带针）轻柔地滑至被拉紧的子宫角下方。
5. 在子宫-输卵管交界处（输卵管后方）和子宫-宫颈交界处（宫颈前方）分别用方结牢固结扎。每个结扎位置暂不剪断缝线末端。
6. 剪下两结扎线之间的子宫角组织，并将组织置于含有约100 μL PBS（含青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL）的无菌玻璃培养皿中。最后剪断丝线的末端。若缝线松脱或出现出血，应找到血管残端并重新打结。

5. 从切除的子宫制备子宫内膜异位病灶

1. 操作离体子宫时，用无菌纱布覆盖腹部，并根据需要使用含有青霉素和链霉素的无菌 PBS 保持湿润。
2. 去除离体子宫角上的脂肪组织。
3. 如需要，称量离体子宫角的重量。
4. 将小型剪刀（14 mm 刀刃长度）的一侧刀刃插入子宫腔内，用镊子夹住子宫角，同时轻轻沿子宫角滑动剪刀，以切开子宫角。
5. 在玻璃培养皿中，使用 2 mm 组织打孔器切取三个大小相同的植入组织样本。

6. 腹膜腔内子宫内膜异位病灶的缝合

1. 在切口部位上方立即放置无菌纱布，并用含有青霉素和链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）充分浸湿。
2. 使用小型平滑镊子轻轻找到盲肠，并沿小肠向头侧方向移动。拉出一段距离盲肠至少两个动脉位置以外的小肠（4-5 cm），将其呈扇形铺展在预先润湿的纱布上，使肠系膜的动脉分支清晰可见。操作过程中务必始终用无菌生理盐水保持肠段湿润。注意：处理肠管时切勿使用鼠齿镊。
3. 使用带P-1、11 mm、3/8圆、反向切割针的6-0黑色爱惜康缝线，将一个植入物轻轻缝合至距离肠管约0.5 cm处的动脉上。
4. 注意：肠系膜表面覆盖有一层薄的腹膜。缝合动脉周围时，应注意干净利落地穿过该层组织。拉紧缝线时应缓慢而小心，避免撕裂腹膜或导致动脉破裂。
5. 完成两个单结，注意不要过度收紧缝线，以免造成血流中断，进而导致肠组织坏死甚至动物死亡。将缝线在距离植入物2 mm处剪断。在进行下一个植入前，再次润湿肠管以持续维持其水合状态。
6. 沿头侧方向继续推进，拉出下一段3-4 cm的肠管，并轻柔地将已含有植入物的肠段复位。跳过前一个植入部位的一个或两个动脉，缝合下一个植入物。对第三个植入物重复此操作。
7. 将所有肠管复位至腹腔内。

7. 假手术

1. 假手术的操作步骤与子宫内膜异位症手术相同，但不将任何组织缝合至肠系膜。
2. 按照第4步的方法切除左侧子宫角。
3. 假手术中不制备子宫内膜异位病灶（第5步）。切除的子宫角可根据需要丢弃或用于其他用途。
4. 按照第6步的方法，在肠系膜动脉级联的三条动脉周围仅放置缝线，不缝合组织。

8. 关闭手术切口

1. 确保所有器官大致恢复至解剖位置。
2. 使用5-0涂膜薇乔缝线，以非锁边连续缝合法缝合腹壁。
3. 使用9 mm伤口夹闭合皮肤。

9. 恢复动物状态

1. 通过皮下注射给予小鼠 0.33 mg/ml 的布托啡诺，剂量为 0.15 ml/25 g 体重，相当于 0.2 mg/kg。术后给予布托啡诺以预防进一步的心血管/呼吸抑制，避免延长恢复过程。
2. 若小鼠在手术过程中被弄湿，需用无尘纸或纸巾轻轻擦干。
3. 将动物腹部朝下放置于笼内，并部分置于循环加热水垫上，直至动物恢复并能够自主维持胸骨卧姿（由于吸入麻醉剂作用迅速消退，通常在五分钟内恢复）。

10. 术后护理

1. 小鼠应每15分钟观察一次，直至能够维持胸卧位，之后改为每小时观察一次，直至术后恢复至正常行为。
2. 小鼠应在术后24小时内恢复正常。术后应每日监测7至10天，观察其恢复情况及健康状况。
   1. 动物健康状况不良、疼痛或痛苦的表现包括活动减少、自残行为、毛发凌乱不整以及蜷缩姿势。
   2. 若小鼠在术后24小时内未恢复正常健康状态，应给予丁丙诺啡（0.2 mg/kg）或实施安乐死。若在追加给予丁丙诺啡后8小时内仍未见改善，则应实施安乐死，因很可能已发生肠坏死。
3. 在造模后7-10天拆除伤口夹。
4. 在整个实验期间，通过阴道细胞学检查持续监测动情周期。在采集样本前72小时，通过将沾有雄鼠尿液的垫料转移至雌鼠笼中（如步骤1.3所述），以同步动情周期。

11. 尸检与组织切除

1. 解剖时机取决于具体的研究问题，将在代表性结果与讨论部分进一步阐述。
2. 采用二氧化碳窒息法处死小鼠。
3. 使用1 mL注射器配23号针头经心脏穿刺采集血液（如需要）。
4. 按照前述方法采集阴道细胞学涂片，以确定采样时的动情周期阶段¹⁷。
5. 在子宫-输卵管连接处及宫颈处切断剩余的子宫角，去除脂肪组织，称重，并按需要进行后续处理（参见11.14和11.15）。
6. 定位子宫内膜异位病灶周围的黑色缝线。如需要，可对完整的子宫内膜异位病灶进行拍照记录。
7. 使用小剪刀和镊子仔细分离子宫内膜异位病灶周围的粘连组织，注意避免刺破病灶。操作应迅速而谨慎，以防止RNA降解。
8. 使用游标卡尺测量并记录子宫内膜异位病灶的长度和宽度。
9. 切除子宫内膜异位病灶，置于经PBS润湿的纸巾上。去除病灶上任何非子宫内膜来源的组织。可使用解剖显微镜或放大镜支架辅助分离操作。
10. 在移除缝线前，称量三个含液体的子宫内膜异位病灶的重量。
11. 轻柔地从子宫内膜异位病灶上移除缝线。
12. 用于组织学分析时，将一个含液体的子宫内膜异位病灶用福尔马林固定2小时，随后用PBS洗涤三次，每次30分钟，最后保存于70%乙醇中。之后进行脱水处理并石蜡包埋。
13. 刺破其中两个子宫内膜异位病灶，并再次称重。由于周期性激素变化可能影响囊肿液量，此步骤可提供组织湿重的测量值，补充11.10步骤中测得的囊肿加液体总重。
14. 用于RNA提取及基因表达研究时，立即将其中一个刺破的子宫内膜异位病灶（或约20 μg子宫组织）在裂解结合液中匀浆，并于-80°C保存，后续使用RNAqueous试剂盒（Ambion）或其他方法进行RNA提取。
15. 为将来提取RNA、DNA或蛋白质，立即将第二个刺破的子宫内膜异位病灶（或约20 μg子宫组织）在液氮中速冻，并于-80°C保存。

代表性结果

在手术诱导的子宫内膜异位症小鼠模型中，子宫内膜异位病灶在形态学和组织学上均与女性患者中观察到的病灶相似。对女性及小鼠模型中子宫内膜异位症的组织学分析表明，子宫内膜异位病灶包含子宫内膜腺体和间质（图2A）。小鼠的子宫内膜异位病灶中也含有含铁血黄素沉积的巨噬细胞，这是女性子宫内膜异位症常见的组织学特征（图2B）¹⁹。

小鼠在诱导后三天切除的子宫内膜异位病灶呈现炎症和出血状态（图3A）。在小鼠模型中，经过两到四周的生长后，子宫内膜异位病灶呈囊样、充满液体，并被腹膜粘连所包围（图3B和图3C）。与诱导时的病灶重量相比，诱导后一个月和两个月时，充满液体的病灶分别增大了306%和862%，而破溃的病灶则分别增大了51%和172%（图4A和图4B）。我们在五次不同的实验中，在诱导后一个月时均获得了稳定的充满液体和破溃的子宫内膜异位病灶重量数据（图5）。诱导后一个月时，充满液体（7.44±3.75 mg）和破溃（2.92±1.23 mg）的子宫内膜异位病灶重量之间存在显著相关性（Pearson相关系数 = 0.669，p < 0.001）。

在3至10个月龄的小鼠中，年龄对病灶大小没有影响。诱导后一个月时，充满液体的或已破溃的子宫内膜异位病灶的重量与动物年龄均无显著相关性（r = -0.136，p = 0.380；以及 r = -0.063，p = 0.698， respectively）。

在动情周期中，由于类固醇激素的影响，小鼠子宫在大小、液体潴留、细胞增殖和形态方面均会发生变化。我们将处于不同动情周期阶段动物的子宫内膜异位病灶重量与剩余完整子宫角的重量进行了比较。在诱导后一个月时，子宫重量与充满液体或已穿刺的子宫内膜异位病灶重量之间均未发现显著相关性（r = -0.046，p = 0.765；以及 r = 0.232，p = 0.155，分别对应）。

在小鼠子宫内膜异位病灶中观察到的基因表达模式与患有该疾病的女性中报道的结果高度相似⁵。诱导后三天，调控细胞外基质重塑、细胞黏附和血管生成的基因显著上调，其中许多基因在病灶生长一个月期间持续保持上调状态。

图与表

图1. 通过自体子宫组织移植在小鼠中手术诱导子宫内膜异位症。结扎左侧子宫角，切除并纵向切开以暴露子宫内膜。制备三个2 mm²的活检组织，每个活检组织缝合至肠系膜动脉级联中的某条动脉。诱导后一个月，子宫内膜异位病灶已充满液体，并被粘连组织包围。

图 2. 子宫内膜异位症小鼠模型在诱导后一个月的苏木精-伊红染色子宫内膜病灶切片，显示（A）子宫内膜腺体和间质的存在；比例尺 = 50 μm；以及（B）含铁血黄素沉积的巨噬细胞，部分由箭头指示；比例尺 = 20 μm。

图 3. 小鼠模型在安乐死后观察到的子宫内膜异位病灶，分别为诱导后三天（A）或诱导后一个月（B 和 C）。

图 4. 对手术诱导子宫内膜异位症的小鼠，在术后一个月或两个月时切除并称量子宫内膜异位病灶。数据以平均值±标准误表示。数据经对数转换，采用单因素方差分析后接单侧Fisher最小显著差异多重比较法，各图中不同字母表示组间差异具有统计学意义。（A）囊肿样、液体填充型子宫内膜异位病灶（N = 10、7 或 5，分别对应诱导时、术后一个月和术后两个月）。（B）穿刺型子宫内膜异位病灶（N = 10、8 或 7，分别对应诱导时、术后一个月和术后两个月）。

图5. 五个独立实验中，诱导后一个月时充满液体与穿刺引流的子宫内膜异位病灶湿重。数据以平均值±标准误表示。实验1、2、3、4和5中，充满液体病灶的小鼠数量分别为N=10、6、8、7和7，穿刺引流病灶的小鼠数量分别为N=0、7、10、8和8。

表 1. 通过阴道细胞学及卵巢与子宫的肉眼观察判断动情期阶段及诱导情况。
卵巢与子宫的外观表现具有时间依赖性。以下观察结果基于每个周期日早晨约8:00处死动物后获取。此外，这些观察具有主观性，通过比较卵巢与子宫角的变化进行判断，比仅观察子宫角更为准确。这些形态学观察旨在补充每日阴道细胞学检测所获得的信息。

表2. 小鼠与大鼠手术比较。

讨论

在小鼠子宫内膜异位症手术诱导过程中，有几个关键参数需要注意。首先，子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，因此该手术应在保留卵巢的动物中进行，或在切除卵巢后补充雌激素的动物中进行²⁰。其次，将子宫内膜组织活检样本缝合至肠系膜动脉级联结构时必须极为谨慎。我们发现，仅使用两个相对宽松的结，每个结打一个结扣，即可固定组织样本，同时避免肠壁血供被结扎，从而防止组织坏死和动物死亡。我们强烈建议在正式实验前先在多只小鼠上进行练习，以确保缝合牢固、组织不会脱落，但又不会过紧而导致肠管坏死。第三，手术过程中必须使用含有青霉素和链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）保持肠组织湿润。第四，应尽量确保子宫内膜异位病灶的大小一致；为此，我们采用直径2 mm的活检打孔器，从切除的子宫组织中制备大小均一的子宫内膜异位植入物。

可根据研究人员的具体需求和科学问题，对本实验方案进行若干修改。一种可能的修改涉及动物的激素状况。子宫内膜异位病灶、残留完整子宫角以及免疫系统中的基因和蛋白表达，可能直接受到采集时间相对于动情周期阶段的影响。有多种方法可用于控制采集时的动情周期阶段，每种方法各有优缺点。例...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石蜡笔	Fisher Scientific	NC9954135
载玻片	Fisher Scientific	12-550-433
滴管	Fisher Scientific	S79383
用于评估阴道细胞学涂片的标准光学显微镜
盐酸丁丙诺啡 c3 (CARJET) 10×1 ml	巴特勒动物健康供应公司	022891
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	14040-117
10,000 U/ml 青霉素，10,000μg/ml 链霉素溶于 0.85% NaCl	Hyclone	SV30010
异氟烷	雅培实验室	05260-05
异氟烷非重复呼吸麻醉系统
循环热水加热垫
30 ml 注射器套管	Fisher Scientific	14-823-16G
无粉无菌手套	Fisher Scientific	19020558
眼用软膏	主要制药公司	10033691
小型电剪	Wahl Clipper Corp.	9861-600
氯己定擦洗	Fisher Scientific	NC9863042
70% 乙醇
多边形无菌区域	布塞医院一次性用品	696
3号手术刀	Fisher Scientific	22-079-657
10号手术刀片	Fisher Scientific	22-079-681
小型手术剪	Roboz外科器械公司	RS-5850
小型锯齿状半弯镊	Roboz 外科手术器械公司	RS-5135
5-0黑色编织丝线缝合线	Ethicon Inc.	K870H
无菌Pyrex玻璃培养皿	康宁	70160-101
2 mm 活检打孔器	Miltex Inc.	33-31
无菌纱布	Kendall	1806
6-0 黑色单丝乙希纶尼龙缝线	Ethicon Inc.	697G
持针器（可选）	World Precision Instruments, Inc.	500023
5-0 未染色编织涂层薇乔缝线	Ethicon Inc.	J490G
9毫米自动夹伤口夹	BD 生物科学	427631
自动缝合器 &和去除剂	BD 生物科学	427630
23G针头	BD 生物科学	305193
1 cc 注射器	BD 生物科学	301025
5倍放大镜支架（可选）	Fisher Scientific	14-648-23
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	SF100-4
游标卡尺	Roboz外科器械公司	RS-6466
包埋盒处理/包埋	Fisher Scientific	15-197-700A
活检泡沫垫	Fisher Scientific	22-038-222
RNAqueous RNA 提取试剂盒	Ambion	AM1912
液氮
带卡扣盖的微量离心平顶管	Fisher Scientific	02-681-240
氯胺酮（可选）	Sigma-Aldrich	K4138
右美托咪定盐酸盐（Domitor，可选）	Tocris Bioscience	2023
安替咪唑（可选）	Sigma-Aldrich	A9611