本文旨在介绍一种用于化疗放疗研究的原位胶质母细胞瘤模型。文章将详细阐述利用颅内模型进行小鼠细胞处理、移植及放射治疗的步骤。
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本文内容
摘要
摘要
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的成人原发性脑肿瘤1。近年来，在理解肿瘤侵袭机制方面已取得显著进展，而将肿瘤直接接种至脑内可提供在生理上适宜的环境中观察侵袭过程的机会2。就人类脑肿瘤而言，目前可用的原位模型通常通过立体定向注射细胞悬液，或通过复杂的开颅手术植入实体肿瘤组织来建立3。在我们的技术中，从组织培养中收获细胞，制备成细胞悬液后直接植入脑内。手术时间约为30分钟，由于小鼠需维持在持续的手术麻醉状态，因此使用注射型麻醉剂。将小鼠置于Stoetling公司制造的立体定位仪（图1）中。手术区域清洁准备后，进行切口，并定位前囟以确定开颅位置。开颅位置位于前囟右侧2 mm、头侧1 mm处。注射深度为颅骨表面下3 mm，细胞以每2分钟2 μl的速率注入。皮肤使用5-0 PDS缝线缝合，术后小鼠置于加热垫上苏醒。根据我们的经验，依据细胞系的不同，治疗可在术后7至10天开始。药物给药方式取决于药物的组成。对于放射治疗，需对小鼠进行麻醉并固定于定制的固定装置中。用铅板覆盖小鼠身体，仅暴露其脑部。对肿瘤发生机制的研究以及对GBM新疗法的评估，需要准确且可重复的脑肿瘤动物模型。因此，我们利用该原位脑模型研究脑微环境与肿瘤之间的相互作用，并评估不同治疗药物在单独使用或联合放疗时的疗效。
方案
一、细胞准备
- 细胞在含10% FBS的DMEM中培养至约80%汇合度，使用一个225 cm²培养瓶3 每植入5只小鼠使用一个培养瓶。
- 吸弃细胞培养液，加入 10 ml 不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞，吸弃 PBS。
- 用3 ml胰蛋白酶消化细胞，孵育10–15分钟，然后加入15 ml培养基中和胰蛋白酶。
- 将所有细胞和培养基用移液器转移至一个50 ml离心管中。两个大培养瓶的细胞和培养基可放入同一个50 ml离心管。
- 在 4 °C 条件下以 1600 rpm 离心 7 分钟。彻底吸除上清液。用 10 ml 冷 PBS 重悬细胞，轻轻吹打混匀以洗涤细胞。确保细胞沉淀与 PBS 均匀混合。悬液应呈浑浊状。
- 此时使用库尔特计数仪进行细胞计数。将细胞在4 °C条件下以1600 rpm离心7分钟。
- 2分钟后nd 离心细胞，吸除所有PBS，再用1 ml PBS重悬。
- 细胞在4 °C、3000 rpm条件下，以1 ml PBS重悬后离心10分钟。吸除PBS，再加入PBS调节终浓度至1×10⁶个细胞/ml。6 每5 μl含U87细胞的数量，其他细胞系可能需要不同的细胞数量和浓度以获得最佳的肿瘤生长效果。
- 最终体积和浓度确定后，将细胞置于冰上，保存在离心管中。
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讨论
恶性胶质瘤（如多形性胶质母细胞瘤）是最常见的原发性脑肿瘤，预后极差4。尽管在外科手术、放疗和化疗方面取得了进展，过去十年中胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存期几乎未有改善（即诊断后约9-12个月）5。用于研究胶质瘤治疗的合适模型应具备以下特征：肿瘤位置可重复，细胞生长形成相对独立的肿瘤；细胞在组织学特征上应尽可能接近人类胶质瘤；肿瘤生长速率可预测，能够在组织培养中生长，且模型应采用小型动物以降低实验成本6。有效的治疗依赖于能够高度模拟人类GBM特征的实验模型，以用于测试新疗法，并准确理解胶质瘤广泛侵袭的分子基础7。对脑肿瘤生物学的研究也常规使用在体外（in vitro）培养或维持的细胞系来获取相关信息8。抑制肿瘤侵袭和血管生成是开发针对恶性胶质瘤新型治疗策略的主要目标之一9。由于胶质母细胞瘤治疗手段有限，科研人员正大力探索该致命癌症背后的遗传损伤，旨在开发出更具针对性和更有效的治疗方法10。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划资助。
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参考文献
- Bleau, A. M., Holland, E. Trapping the mouse genome to hunt human alternations. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).
- McGrady, B. J., McCormick, D. A murine model of intracranial invasion: morphological ob....
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