利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

摘要

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs 突变株的实验方案。

摘要

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，并在反刍动物中引发高流产率和胎儿畸形¹，已被列为美国卫生与公共服务部（HHS）/美国农业部（USDA）重叠指定的管制病原体（select agent）以及生物安全三级（risk group 3）病原体。该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中的斐波病毒属（Phlebovirus），是该科中致病性最强的成员之一。自2006年以来，已陆续建立了针对RVFV MP-12疫苗株^2,3以及包括ZH548和ZH501在内的野生型RVFV毒株^4-6的多种反向遗传学系统。MP-12毒株属于生物安全二级病原体（risk group 2 pathogen），且不属于管制病原体（non-select agent），其M片段和L片段存在多个突变，因而毒力显著减弱，但仍携带具有致病性的S片段RNA³，该片段编码一种功能性毒力因子NSs。携带NSs开放阅读框（ORF）框内缺失69%的重组病毒rMP12-C13type（C13type）丧失了所有已知的NSs功能，但在缺乏I型干扰素（IFN）的VeroE6细胞中，其复制效率与MP-12相当。NSs可导致宿主转录全面关闭，包括干扰素（IFN）-β mRNA的转录抑制^7,8，并在翻译后水平促进双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的降解^9,10。IFN-β的转录上调依赖于干扰素调节因子3（IRF-3）、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）；IFN-β与IFN-α/β受体（IFNAR）结合后，可激活IFN-α基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）的转录¹¹，从而诱导宿主抗病毒反应；然而，尽管RVFV感染可激活IRF-3、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），NSs介导的宿主转录抑制（包括IFN-β基因）会阻断这些ISGs在病毒复制过程中的表达上调。因此，NSs是进一步减弱MP-12毒力、并通过消除IFN-β抑制功能来增强宿主先天免疫反应的理想靶点。本文描述了一种构建表达突变型NSs的重组MP-12病毒的实验方案，并提供了一种筛选无法抑制IFN-β mRNA合成的NSs突变体的方法示例。除了在先天免疫中的关键作用外，I型IFN还对树突状细胞的成熟及适应性免疫应答的启动具有重要作用^12-14。因此，能够诱导I型IFN产生的NSs突变体不仅毒力进一步减弱，同时比野生型MP-12更能有效激发宿主免疫应答，使其成为疫苗开发的理想候选株。

方案

1. 从质粒DNA中拯救重组MP-12编码NSs突变²

1. 将稳定表达T7 RNA聚合酶的幼年仓鼠肾（BHK）/T7-9细胞¹⁵接种于6 cm培养皿中，培养基为含10%胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（青霉素：100 U/mL，链霉素：100 μg/mL）（Invitrogen，货号#15140122）和600 μg/mL潮霉素B（Cellgro，货号#30-240-CR）的最低必需培养基（MEM）-alpha（Invitrogen，货号#32561037）。
   * 病毒回收效率在6 cm培养皿中高于35 mm培养皿。低传代次数的BHK/T7-9细胞支持更高的病毒回收率。也可使用其他稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞系^4,5,16,17。
2. 当细胞融合度达到70–80%时，弃去原培养上清，更换为含10% FBS和青霉素-链霉素（不含潮霉素B）的新鲜MEM-alpha培养基。
   
   * 更换培养基后应在1小时内进行转染，以避免T7 RNA聚合酶表达水平下降。
3. 为回收裂谷热病毒（RVFV），需要两组质粒：一组编码病毒基因组RNA以实现全长病毒RNA表达，另一组编码病毒基因的开放阅读框以实现病毒蛋白表达（图1和图2）。在1.5 mL离心管中配制以下质粒混合物（图2）：
   1. pProT7-S(+)（含NSs基因突变）（....

讨论

多个研究团队通过利用T7启动子，已开发出针对裂谷热病毒（RVFV）的反向遗传学系统^2,4,5 或小鼠³ 或人类⁴ pol-I 启动子。在本文中，我们描述了一种利用 BHK/T7-9 细胞生成重组 RVFV MP-12 毒株的实验方案¹⁵ 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞。病毒拯救效率因BHK/T7-9细胞状态、质粒用量、转染细胞数量等因素而异。我们始终在Vero E6细胞中扩增P0代病毒，以获得高滴度的病毒储备液用于实验。对于I型干扰素应答功能完整的细胞（如人肺二倍体MRC-5细胞），只有当NSs蛋白能够通过抑制包括I型干扰素和PKR在内的抗病毒反应从而支持高效病毒复制时，才可用于病毒扩增。

空斑试验是滴定MP-12及其NSs突变株的一种非常有用的方法。进行空斑试验时的一般注意事项是：在去除病毒接种液后，应立即在适当温度下加入覆盖物。结晶紫染色不适用于检测C13type病毒的空斑，因为C13type病毒不会破坏Vero E6细胞的单层结构²。另一方面，中性红染色能够成功检.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
最低必需培养基（MEM）-alpha	Invitrogen	32561037
Dulbecco’s 修饰的最低必需培养基	Invitrogen	11965092
改良Eagle培养基（MEM 2x）	Invitrogen	11935046
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
潮霉素B	Cellgro	30-240-CR
胰蛋白胨磷酸盐肉汤	MP Biomedicals	1682149
贵族琼脂	VWR international	101170-362
TransIT-LT1	Mirus Bio LLC	MIR2300
Opti-MEM	Invitrogen	31985070
防气溶胶密封盖	Eppendorf	C-2223-25
0.33% 中性红溶液	Sigma-Aldrich	N2889-100ML
C57/WT MEF 细胞	Invitrogen	mef-c57wt
杀稻瘟菌素S	Invitrogen	Ant-bl-1
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1
QUANTI-Blue	Invitrogen	rep-qb1
BHK/T7-9 细胞15	Gifu university, Japan
Vero E6 细胞	ATCC	CRL-1586