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方法文章

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

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DOI：

10.3791/3400

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2011年11月1日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs 突变株的实验方案。

摘要

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，并在反刍动物中引发高流产率和胎儿畸形1，已被列为美国卫生与公共服务部（HHS）/美国农业部（USDA）重叠指定的管制病原体（select agent）以及生物安全三级（risk group 3）病原体。该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中的斐波病毒属（Phlebovirus），是该科中致病性最强的成员之一。自2006年以来，已陆续建立了针对RVFV MP-12疫苗株2,3以及包括ZH548和ZH501在内的野生型RVFV毒株4-6的多种反向遗传学系统。MP-12毒株属于生物安全二级病原体（risk group 2 pathogen），且不属于管制病原体（non-select agent），其M片段和L片段存在多个突变，因而毒力显著减弱，但仍携带具有致病性的S片段RNA3，该片段编码一种功能性毒力因子NSs。携带NSs开放阅读框（ORF）框内缺失69%的重组病毒rMP12-C13type（C13type）丧失了所有已知的NSs功能，但在缺乏I型干扰素（IFN）的VeroE6细胞中，其复制效率与MP-12相当。NSs可导致宿主转录全面关闭，包括干扰素（IFN）-β mRNA的转录抑制7,8，并在翻译后水平促进双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的降解9,10。IFN-β的转录上调依赖于干扰素调节因子3（IRF-3）、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）；IFN-β与IFN-α/β受体（IFNAR）结合后，可激活IFN-α基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）的转录11，从而诱导宿主抗病毒反应；然而，尽管RVFV感染可激活IRF-3、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），NSs介导的宿主转录抑制（包括IFN-β基因）会阻断这些ISGs在病毒复制过程中的表达上调。因此，NSs是进一步减弱MP-12毒力、并通过消除IFN-β抑制功能来增强宿主先天免疫反应的理想靶点。本文描述了一种构建表达突变型NSs的重组MP-12病毒的实验方案，并提供了一种筛选无法抑制IFN-β mRNA合成的NSs突变体的方法示例。除了在先天免疫中的关键作用外，I型IFN还对树突状细胞的成熟及适应性免疫应答的启动具有重要作用12-14。因此，能够诱导I型IFN产生的NSs突变体不仅毒力进一步减弱，同时比野生型MP-12更能有效激发宿主免疫应答，使其成为疫苗开发的理想候选株。

方案

1. 从质粒DNA中拯救重组MP-12编码NSs突变2

  1. 将稳定表达T7 RNA聚合酶的幼年仓鼠肾（BHK）/T7-9细胞15接种于6 cm培养皿中，培养基为含10%胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（青霉素：100 U/mL，链霉素：100 μg/mL）（Invitrogen，货号#15140122）和600 μg/mL潮霉素B（Cellgro，货号#30-240-CR）的最低必需培养基（MEM）-alpha（Invitrogen，货号#32561037）。
    * 病毒回收效率在6 cm培养皿中高于35 mm培养皿。低传代次数的BHK/T7-9细胞支持更高的病毒回收率。也可使用其他稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞系4,5,16,17。
  2. 当细胞融合度达到70–80%时，弃去原培养上清，更换为含10% FBS和青霉素-链霉素（不含潮霉素B）的新鲜MEM-alpha培养基。

    * 更换培养基后应在1小时内进行转染，以避免T7 RNA聚合酶表达水平下降。
  3. 为回收裂谷热病毒（RVFV），需要两组质粒：一组编码病毒基因组RNA以实现全长病毒RNA表达，另一组编码病毒基因的开放阅读框以实现病毒蛋白表达（图1和图2）。在1.5 mL离心管中配制以下质粒混合物（图2）：
    1. pProT7-S(+)（含NSs基因突变）（2 mg）：该质粒在T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列之间插入了反义（正链）全长RVFV MP-12 S基因组片段。
    2. pProT7-M(+)（2 mg）：该质粒在T7启动子和HDV核酶序列之间插入了反义（正链）全长RVFV MP-12 M基因组片段。
    3. pProT7-L(+)（2 mg）：该质粒在T7启动子和HDV核酶序列之间插入了反义（正链）全长RVFV MP-12 L基因组片段。
    4. pT7-IRES-vN（2 mg）：该质粒在T7启动子和脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）下游插入了RVFV MP-12 N基因的开放阅读框（ORF）。
    5. pT7-IRES-vL（1 mg）：该质粒在T7启动子和EMCV IRES下游插入了RVFV MP-12 L基因的ORF。
    6. pCAGGS-vG（1 mg）：该质粒在鸡β-肌动蛋白启动子下游插入了RVFV MP-12 M基因的ORF。
      * 添加pT7-IRES-vN、pT7-IRES-vL和pCAGGS-vG对MP-12病毒的回收并非必需，但可提高拯救效率2。作者曾发现使用pT7-IRES质粒时Gn/Gc蛋白表达水平较低，可能由于核糖体无法有效进行AUG起始密码子的渗漏扫描。因此，我们构建了pCAGGS-vG质粒以实现帽依赖性的Gn/Gc蛋白表达。

  4. 在1.5 mL离心管中加入30 μL TransIT-LT1（Mirus，货号#MIR2300）和385 μL Opti-MEM（Invitrogen，货号#31985070），短暂涡旋混匀。
  5. 室温孵育5分钟后，缓慢将含脂质体的Opti-MEM溶液加入第1.3步的质粒混合物中，用移液器轻柔吹打混匀，室温孵育15分钟。
  6. 将脂质体与质粒的混合物逐滴加入第1.2步的BHK/T7-9细胞培养液中（图3）。
  7. 将转染后的细胞置于含5% CO2的37°C培养箱中孵育24小时，随后弃去原培养上清，更换为含10% FBS和青霉素-链霉素（不含潮霉素B）的新鲜MEM-alpha培养基。
  8. 继续在含5% CO2的37°C培养箱中孵育4天（总计孵育5天），收集培养上清至15 mL离心管中。

    * 此处观察到的细胞病变效应（CPE）不一定代表病毒成功回收，因为转染本身可诱导细胞死亡，其形态与病毒RNA复制或病毒蛋白合成引起的CPE相似。
  9. 在4°C条件下，以2,200 ×g离心5分钟，去除上清中的细胞碎片。

    * 此步骤旨在沉淀病毒原液中的细胞碎片。为提高生物安全性，建议使用防气溶胶密封的离心桶。
  10. 将上清转移至带螺口盖的5 mL冻存管中，将第0代（P0）病毒原液于-80°C保存备用。

2. P0 病毒的扩增

  1. P0 样本中的病毒滴度通常不足以用于后续实验2。在 VeroE6 细胞中进行扩增可将病毒滴度提高至最高水平，VeroE6 细胞是非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）的一个克隆株，缺乏 IFN-α/β 基因18,19。也可选用其他缺乏 I 型干扰素应答的细胞，例如 Hec1B 细胞20 或来自 IFNAR1 基因敲除小鼠的 MEF 细胞21 进行此步骤。将 VeroE6 细胞以含 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（青霉素：100 U/ml，链霉素：100 mg/ml）的杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）（Invitrogen，货号# 11965092）接种于 10 cm 培养皿中，并在含 5% CO2 的 37°C 培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80%。
    * 编码突变 NSs 的重组 MP-12 毒株通常在 I 型干扰素功能完整的细胞中复制效率低下。
  2. 将 300 µl 的 P0 样本与 2.7 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素的 DMEM 混合。移除步骤 2.1 中 VeroE6 细胞的培养基，加入稀释后的 P0 样本。在含 5% CO2 的 37°C 培养箱中孵育 1 小时。
  3. 移除接种液，每皿加入 10 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素的 DMEM。
  4. 在 37°C 培养 3 至 4 天，直至 VeroE6 细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）。
    * MP-12 感染过程中单层细胞会破裂，而缺失 NSs 的重组 MP-12 毒株（例如 rMP12-C13type（C13type））（图 4）不会破坏单层细胞，但在感染后 2 至 3 天会出现大量死亡的悬浮细胞。
  5. 在感染后第 3 至 4 天收集上清液，方法如第 1.9 和 1.10 节所述，并将样本命名为 E6P1。

3. 通过蚀斑实验滴定重组 MP-12

  1. 将 VeroE6 细胞接种至 6 孔板中。
    * 每个样本进行重复检测比单次检测更可靠。
  2. 当 VeroE6 细胞生长至 80% 汇合度时，用含 10% 胎牛血清和青霉素-链霉素的 DMEM 培养基将病毒样本进行 10 倍系列稀释，直至 10-6，步骤如下：
    • 10 μl E6P1 样品 + 990 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素的 DMEM（10-2 稀释
    • 100 μl 第 10 页-2 样品 + 900 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素的 DMEM（10-3 稀释
    • 100 μl 10 中的-3 样本 + 900 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素（10-4 稀释
    • 100 μl 第 10 页-4 样品 + 900 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素（10-5 稀释度）的 DMEM 培养基
  3. 吸弃步骤 3.1 中 6 孔板中的培养基，并加入 400 μl 将每个稀释液（来自步骤 3.2）加入到孔中（图3).
  4. 孵育于 37°C 在含5% CO₂的培养箱中孵育1小时2.
  5. 孵育期间，按下述方法准备两个15 ml离心管用于琼脂覆盖：
    管 A（保留于 42°C 水浴：7 ml 含1.2% noble agar（VWR，货号#101170-362）的水溶液
    管B（保留于 37°C 水浴）：7 ml 含10% FBS、青霉素-链霉素（青霉素：100 U/ml，链霉素： 100 μg/ml），以及10% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（MP Biomedicals，货号#1682149）。
  6. 孵育1小时后，吸除病毒接种液，每孔立即加入2 ml A管与B管溶液（来自步骤3.5）的1:1混合液。
    * 加入覆盖层时需迅速操作，因为孔板干燥会导致未感染细胞死亡。
  7. 将培养板置于培养箱中孵育 37°C 在含5% CO的培养箱中培养3天2.
  8. 按照步骤 3.5 所述再次准备试管 A 和试管 B。同时准备 500 μl 每块培养板加入0.33%中性红溶液（Sigma Aldrich，货号#N2889-100ML），同样置于 37°C 水浴锅
  9. 将 A 管、B 管与 500 ml 中性红溶液（终浓度 0.011%）混合，每孔加入 2 ml 混合液。
    * 中性红溶液的添加量因中性红溶液批次不同而异，需进行初步优化。0.33%中性红溶液长期储存会导致沉淀。在此情况下，可通过孵育使沉淀完全溶解 55°C 10分钟，随后剧烈振荡。使用沉淀的中性红溶液会导致细胞染色较弱，而重新溶解的中性红溶液则能良好地染色细胞。
  10. 将培养板在37°C下孵育16小时（或过夜） 37°C 在含5% CO₂的培养箱中2.
  11. 计数每个孔中数量在10到100之间的噬斑。计算每毫升的噬斑形成单位数（plaque forming units/ml）。例如，若在接种了10⁻⁶稀释度病毒液的孔中观察到28个噬斑-5 稀释倍数，28（空斑数）×（1 ml/0.4 ml）× 105 （稀释倍数）= 7.0 × 106 空斑形成单位 (pfu)/ml图5).

4. 筛选缺乏I型干扰素抑制功能的NSs突变体

  1. 将携带可被 NF-kB 和 IRF-3/7 诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因的 C57/WT MEF 细胞（InvivoGen，货号#mef-c57wt）接种于 12 孔板中。图 6 显示了该系统原理。细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（青霉素：100 U/ml，链霉素：100 μg/ml）、Blasticidin S（3 mg/ml）和 Zeocin（100 μg/ml）的 DMEM 培养基中。
  2. 当细胞达到亚汇合状态（约 80%）时，用 MP-12 或携带 NSs 突变的重组 MP-12 病毒以感染复数（moi）3 或 0.1 进行模拟感染或感染（参见第 2 和第 3 节，每孔接种液体积应为 300 μl）。感染后 1 小时，吸除接种液，每孔加入 1 ml 含 10% FBS 和青霉素-链霉素（青霉素：100 U/ml，链霉素：100 μg/ml）的 DMEM 培养基（此时不再添加 Blasticidin 和 Zeocin）。
  3. 感染后 14 小时，收集细胞培养上清液。取 200 μl QUANTI-Blue 检测试剂（InvivoGen，货号# rep-qb1）与 50 μl 样品（每个样品设三个重复）加入 96 孔板中。密封后，于 37°C 孵育 1 小时。
    * 在 I 型干扰素（IFN-alpha/beta）功能完整的细胞（如 293 细胞、MRC-5 细胞和小鼠胚胎成纤维细胞 MEF）中，MP-12 及缺失 NSs 的重组 MP-12 在高感染复数下感染 14 小时后均能明显诱导宿主翻译抑制。另一方面，在 I 型干扰素应答完整的细胞中，IFN-beta mRNA 或 ISG56 mRNA 在感染后 7 至 8 小时已大量积累。因此，我们选择在感染后 14 小时收集上清液，以检测由先天免疫反应诱导的 SEAP 蛋白积累情况。
  4. 使用酶标仪在 650 nm 波长下读取吸光度（OD）值（图 7）。
    * 该结果与使用特异性针对小鼠 ISG56 mRNA 的 RNA 探针进行 Northern 印迹分析所获得的数据一致，均显示在无 NSs 表达的情况下 ISG56 mRNA 显著上调（图 8）。
    * 需注意的是，SEAP 活性反映的是蛋白丰度，而蛋白水平可能受到宿主翻译活性的影响。由于在细胞翻译受抑制时即使存在 SEAP mRNA 也无法合成 SEAP 蛋白，因此 SEAP 蛋白的相对水平可能低于 mRNA 的升高幅度。相比 SEAP 报告系统，Northern 印迹是一种更直接且更准确的方法，用于评估感染细胞中因缺失 NSs 功能而诱导的 mRNA 表达量。然而，SEAP 报告系统比 Northern 印迹更快，因此适用于快速筛选可能丧失抑制宿主转录功能的 NSs 突变体。

5. 代表性结果：

反向遗传学系统稳定地生成了具有感染性的重组MP-12病毒，其滴度高于1 × 106 pfu/ml。缺失NSs功能的C13type病毒形成较大且浑浊的蚀斑，而MP-12则形成大小不一的透明蚀斑2（图5）。与未处理的对照组细胞相比，模拟感染的C57/WT小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或感染MP-12的细胞在培养上清液中均未升高SEAP水平；而感染C13type病毒的C57/WT MEF细胞在感染后14小时（hpi）即表现出培养上清液中SEAP水平的升高（图7）。这些结果与使用特异性针对小鼠ISG56 mRNA的RNA探针进行Northern印迹分析所得结果一致（图8）。

RVFV基因组结构示意图；各片段及其编码蛋白：S、M、L；RNA聚合酶、核苷酸大小。
图1.  RVFV的基因组结构
RVFV具有三段式负链或双向编码RNA基因组，分别为S、M和L片段。S片段以双向编码方式编码N和NSs基因。N的mRNA由病毒正义（负义）S片段转录生成，而NSs的mRNA则由抗病毒正义（正义）S片段转录生成。M片段编码一条单一的M mRNA，通过在M mRNA 5'区多个AUG起始密码子处的“渗漏扫描”机制，翻译生成78kD、NSm、Gn和Gc蛋白，随后在翻译过程中发生共翻译切割22,23。L片段编码L蛋白。N蛋白和L蛋白对病毒的转录与复制至关重要，Gn和Gc为病毒包膜蛋白。NSs和NSm为非结构蛋白，不被整合入病毒颗粒中。

重组RVFV基因组和病毒蛋白表达的质粒DNA设计示意图，带有T7启动子。
图2.  用于拯救重组RVFV MP-12株的质粒DNA设计
编码全长反病毒正义链S、M或L节段的cDNA分别克隆于T7启动子下游及乙型肝炎delta病毒（HDV）核酶序列上游，相应命名为pProT7-S(+)、pProT7-M(+)或pProT7-L(+)2。在BHK/T7-9细胞中表达的T7 RNA聚合酶可转录出具有精确基因组3’端的全长S、M或L节段RNA。N蛋白或L蛋白的开放阅读框（ORF）被克隆至脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）下游，分别命名为pT7-IRES-vN或pT7-IRES-vL，从而使无帽结构的T7 RNA转录本能够以非依赖帽子的方式被核糖体识别。M ORF被克隆至pCAGGS质粒的鸡β-肌动蛋白启动子下24，命名为pCAGGS-vG，以实现78kD蛋白、NSm、Gn和Gc蛋白的合成，这些蛋白通过泄漏扫描机制从不同的AUG起始密码子翻译产生23。启动转录或RNA复制需要N蛋白和L蛋白的共同存在，而pT7-IRES-vN和pT7-IRES-vL对于重组MP-12的拯救并非必需2，这可能是由于pProT7-S(+)和pProT7-L(+)中由Pol-II驱动产生的编码N-ORF和L-ORF的有帽RNA转录本可能存在泄漏表达所致。

RVFV MP-12 从质粒DNA中回收的示意图：转染、扩增、空斑实验流程。
图 3.  从质粒DNA中回收RVFV MP-12
将pProT7-S(+)、pProT7-M(+)、pProT7-L(+)、pT7-IRES-vN、pT7-IRES-vL和pCAGGS-vG质粒（图1）共转染至BHK/T7-9细胞，可在培养上清液中产生具有感染性的重组RVFV MP-12毒株。转染后第5天收集上清液，并接种至新鲜的Vero E6细胞中进行病毒扩增。通常在感染后3至4天可回收到超过1 × 106 pfu/mL的病毒。扩增后的病毒（E6P1病毒）使用Vero E6细胞通过空斑实验测定滴度，并用于表型分析和免疫原性研究。

S片段基因图谱，显示MP-12和rMP12-C13type结构及Asp-Val突变位点。
图4.  MP-12与rMP12-C13type的S片段比较
MP-12与rMP12-C13type（C13type）S片段的对比。与MP-12株的NSs相比，C13type的NSs开放阅读框截短了69%，且与自然分离的克隆13株的序列一致2,25。

MP-12 和 C13type 的蚀斑实验示意图；病毒滴度计算的实验设置。
图 5. MP-12（具有功能性的 NSs）和 C13type（无功能性的 NSs）的蚀斑实验
使用 6 孔板中的 Vero E6 细胞单层进行蚀斑实验。接种病毒后，在含 0.6% 琼脂的覆盖培养基中孵育 3 天，随后加入含有中性红溶液的第二层琼脂覆盖培养基。感染后第 4 天计数蚀斑。MP-12 形成大小不一的透明蚀斑，而 C13type 形成较大的浑浊蚀斑（或病灶）。应选择每个孔中蚀斑数量为 10 至 100 的用于计数。

SEAP报告基因的激活通路；示意图显示IFN-α/β启动子及MP-12 NSs的影响
图6. C57/WT MEF 细胞中分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因的激活通路
干扰素-β 启动子包含 AP-1、NF-κB 和 IRF-3 的结合序列。RVFV 复制可激活 AP-1、NF-κB 和 IRF-3。7,11然而，即使在这些转录因子结合后，NSs仍能抑制抑制性复合物从IFN-beta启动子上解离，从而抑制IFN-beta mRNA的合成26此外，NSs 会结合 TFIIH 的 p44 亚基8，并促进 TFIIH p62 亚基的降解。27，从而引起宿主整体转录抑制，包括IFN-alpha基因及受干扰素敏感反应元件（ISRE）启动子调控的基因。C13型或其他缺乏抑制IFN-beta功能的NSs突变体可诱导IFN-beta合成，后者继而激活IFN-alpha启动子和干扰素敏感反应元件（ISRE）启动子。IRF-7随后被IFN-alpha/beta刺激转录上调，并在IFN-alpha的进一步作用下持续上调，以协同支持IRF-3的功能28,29在此检测中，C57/WT MEF 细胞在 NF-kB、IRF-3 和 IRF-7 的人工结合序列下游编码分泌型碱性磷酸酶（SEAP）。因此，缺乏抑制 IFN-beta 功能的 NSs 突变体会上调 SEAP 的表达，随后通过检测其分泌量进行测定。

C13type在C57/WT MEF细胞中诱导SEAP表达；柱状图；与mock对照组相比在14 hpi时的倍数变化。
图7.  C13type对SEAP的诱导作用
将C57/WT MEF细胞（InvivoGen）进行mock感染或分别以MOI为3（左图）或0.01（右图）感染MP-12或rMP12-C13type（C13type）。在感染后14小时收集培养上清液（50 μl），与200 μl QUANTI-Blue（InvivoGen）底物混合于96孔板中，37°C孵育1小时后用酶标仪测定650 nm处的OD值。图中显示相对于mock感染细胞的SEAP活性相对增加量。数据为三次独立实验的平均值±标准差。C13type感染细胞的培养上清液中SEAP水平升高，提示NSs蛋白缺失导致宿主转录抑制功能丧失。

使用 DIG 标记的 RNA 探针进行的 Northern 印迹图，显示 MP-12 和 C13type 样品中的 ISG56 mRNA。
图 8. 使用 DIG 标记的 RNA 探针进行的 Northern 印迹
野生型小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞经模拟感染或以 MOI 为 3 的 MP-12 或 rMP12-C13type（C13type）病毒感染。在感染后 7 小时使用 Trizol（Invitrogen）提取总 RNA，并使用地高辛标记的 RNA 探针进行 Northern 印迹，该探针特异性针对小鼠内源性 ISG56 mRNA 或 MP-12 N mRNA/抗病毒正义 S 片段2,30。用于制备小鼠内源性 ISG56 mRNA 或 RVFV N mRNA/抗病毒正义 S 片段的探针时，采用引物对 KpnmISG56F（GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG）和 HindmISG56（TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG）扩增 ISG56 mRNA，或采用引物对 KpnNF（AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G）和 HindNR（GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG）扩增 RVFV N mRNA/抗病毒正义 S 片段，PCR 产物经 KpnI 和 HindIII 双酶切后，连接至 pSPT18 质粒（Roche）。随后使用 DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7）（Roche，货号#1 175 025）合成地高辛标记的 RNA 探针。各样品的 28S rRNA 水平同时展示，作为上样对照。感染 C13type 的野生型 MEF 细胞可诱导 ISG56 mRNA 的合成，而感染 MP-12 的细胞则不能诱导，表明 C13type 感染细胞中缺乏宿主转录抑制作用。该结果与图 6 中 SEAP 检测所得数据一致。

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讨论

多个研究团队通过利用T7启动子，已开发出针对裂谷热病毒（RVFV）的反向遗传学系统2,4,5 或小鼠3 或人类4 pol-I 启动子。在本文中，我们描述了一种利用 BHK/T7-9 细胞生成重组 RVFV MP-12 毒株的实验方案15 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞。病毒拯救效率因BHK/T7-9细胞状态、质粒用量、转染细胞数量等因素而异。我们始终在Vero E6细胞中扩增P0代病毒，以获得高滴度的病毒储备液用于实验。对于I型干扰素应答功能完整的细胞（如人肺二倍体MRC-5细胞），只有当NSs蛋白能够通过抑制包括I型干扰素和PKR在内的抗病毒反应从而支持高效病毒复制时，才可用于病毒扩增。

空斑试验是滴定MP-12及其NSs突变株的一种非常有用的方法。进行空斑试验时的一般注意事项是：在去除病毒接种液后，应立即在适当温度下加入覆盖物。结晶紫染色不适用于检测C13type病毒的空斑，因为C13type病毒不会破坏Vero E6细胞的单层结构2。另一方面，中性红染色能够成功检...

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致谢

本工作由西部卓越区域中心（WRCE）资助项目编号5 U54 AI057156-07、美国国家过敏与传染病研究所资助项目编号1 R01 AI08764301-A1，以及德克萨斯大学医学分部Sealy疫苗开发中心的内部资助共同支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
最低必需培养基（MEM）-alpha Invitrogen32561037
Dulbecco’s 修饰的最低必需培养基 Invitrogen11965092
改良Eagle培养基（MEM 2x） Invitrogen11935046
青霉素-链霉素 Invitrogen15140122
潮霉素B Cellgro30-240-CR
胰蛋白胨磷酸盐肉汤 MP Biomedicals1682149
贵族琼脂 VWR international101170-362
TransIT-LT1 Mirus Bio LLCMIR2300
Opti-MEM Invitrogen31985070
防气溶胶密封盖 EppendorfC-2223-25
0.33% 中性红溶液 Sigma-AldrichN2889-100ML
C57/WT MEF 细胞Invitrogenmef-c57wt
杀稻瘟菌素SInvitrogenAnt-bl-1
ZeocinInvitrogenant-zn-1
QUANTI-BlueInvitrogenrep-qb1
BHK/T7-9 细胞15 Gifu university, Japan
Vero E6 细胞ATCCCRL-1586

参考文献

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NSs Vero E6 BHK T7 9 SEAP
利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性
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