分离收缩性淋巴管中胞质 Ca2+ 的测定

摘要

我们介绍一种评估分离淋巴管中胞质Ca²⁺浓度的方法，用于研究淋巴管平滑肌收缩的Ca²⁺依赖性及Ca²⁺敏感化机制。

摘要

淋巴管构成一个多功能的运输系统，可维持体液稳态，将脂质输送至中心循环，并作为对潜在有害抗原的监视系统，从而优化黏膜免疫和适应性免疫应答¹。淋巴液由进入盲端起始淋巴管的组织间液形成，随后在较大的集合淋巴管中逆压力梯度被运输。每条集合淋巴管由一系列称为淋巴管节的节段构成，节段之间由防止逆流的二叶瓣膜分隔。每个淋巴管节均具有收缩周期，可逆压力梯度将淋巴液推向中心循环²。这种节律性收缩模式类似于心脏周期，具有收缩期和舒张期，但收缩频率较低⁴。此外，淋巴管平滑肌可产生张力，并分别在管腔压力升高和降低时表现出肌源性收缩和舒张⁵。因此，目前提出存在一种支持淋巴管节律性和紧张性收缩的分子机制混合模式。

平滑肌的收缩通常由细胞质内 Ca²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_i）以及收缩元件对细胞周围环境变化所引发的 Ca²⁺ 敏感性共同调节⁶。[Ca²⁺]_i 取决于 Ca²⁺ 通过质膜上的配体门控或电压门控 Ca²⁺ 通道的跨膜移动，以及细胞内储存库中 Ca²⁺ 的释放与再摄取。细胞质中的 Ca²⁺ 与钙调蛋白结合，激活诸如肌球蛋白轻链（MLC）激酶（MLCK）等酶，后者进一步使 MLC 磷酸化，从而引发肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩⁸。然而，该通路对 Ca²⁺ 的敏感性可由 MLC 磷酸酶（MLCP）进行调节⁹。MLCP 的活性受 Rho 激酶（ROCK）和肌球蛋白磷酸酶抑制蛋白 CPI-17 的调控。

此处我们介绍一种用于评估[Ca²⁺]_i 随着时间推移，在分离的灌注淋巴管中研究 Ca²⁺-依赖性和Ca²⁺- 淋巴管平滑肌收缩的致敏机制。利用分离的大鼠肠系膜集合淋巴管，我们研究了牵张诱导的[Ca²⁺]_i 和收缩活动。离体淋巴管模型的优势在于能够严格控制压力、 flow 以及灌流液的化学成分。[Ca²⁺]_i 通过使用比率型 Ca 染料负载淋巴管来确定²⁺-结合染料Fura-2。这些研究将为更广泛地探究调控淋巴平滑肌时相性收缩与紧张性收缩的不同分子机制提供一种新方法。

方案

1. 动物

1. 所有实验程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院指南（NIH出版物第85-12号，1996年修订版）进行。雄性Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories，体重270–350 g）饲养于温度受控的环境中22 °C）以及可控光照（12小时光照/12小时黑暗循环）环境。大鼠到达后，经过为期一周的适应期，期间提供标准大鼠饲料（2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan）和饮水 随意摄取.

2. 实验设置

1. 用于固定淋巴管的玻璃微移液管由含丝硼硅酸盐玻璃制成，外径为1.2 mm，内径为0.69 mm（Sutter Instrument BF 120-69-15）。使用Flaming/Brown微移液管拉制仪（Sutter Instrument P-97型）拉制移液管，并用显微研磨器（Narishige EG 400型）进行斜面打磨，以获得外径约为60 μm的斜面尖端。
2. 将微移液管安装至离体血管灌流腔室（Living Systems公司CH-1型，佛蒙特州伯灵顿）。移液管应匹配电阻（即开口尺寸相同）。
3. 用含白蛋白的生理盐溶液（APSS，见表1）填充腔室（5 mL）和微移液管。确保微移液管和管路中无气泡。
4. 使用眼科缝线打单结，并在每根微移液管上放置一个结。

3. 收集淋巴管分离

1. 使用BD注射器（1 ml）和针头（BD皮内斜面26G3/8），通过肌肉注射给予氯胺酮/赛拉嗪（剂量分别为90和9 mg/kg）对动物进行麻醉。
2. 用70%酒精喷洒腹部区域以消毒，行正中腹切开术，取出并切除小肠及肠系膜。将组织置于冰冻的APSS溶液中。通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪实施安乐死，并通过打开胸腔确认动物死亡（依据美国兽医协会安乐死指南）。
3. 将一段肠系膜固定在盛有冰冻APSS的解剖室中。在体视显微镜下，仔细从周围脂肪和结缔组织中分离出一条收集性淋巴管（内径80–200 μm，长度1–2 mm）。使用Dumont不锈钢解剖镊子-INOX 55（Fine Science Tools #11255-20）和解剖弹簧剪刀（Fine Science Tools #15000-03）。实验中应选用仅含一个瓣膜的分离淋巴管，以确保整个管段在实验期间具有最佳的压力控制。
4. 将分离的淋巴管转移至含有5 ml APSS的离体血管灌流室中。用眼科缝线将血管两端绑扎固定在两个阻抗匹配的玻璃微移液管上。
5. 将灌流室置于倒置荧光显微镜（本实验使用Nikon TE-2000U）上，显微镜配备氙灯（Sutter Instruments Lambda LS2 300 W）、340/380滤光轮系统（Sutter Lambda 10-3，配有Chroma Technology 340和380 nm激发滤光片）、510 nm二向色发射镜（Chroma Technology D510/80m）、高灵敏度CCD相机（Photometrics HQ²）以及图像采集软件（Nikon Elements AR）（图1）。
6. 将来自微移液管的导管连接至可调节储液器或伺服反馈泵系统（Living Systems Instrumentation, Burlington VT），两者均可用于调节压力和流量。
7. 将灌流室连接至加热装置（Living Systems），并将浴液温度设定为37 °C。
8. 通过灌流室底部的盖玻片，使用10X物镜（Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞/0.17, WD 16.0）直接观察淋巴管。可利用图像采集软件（本系统使用Nikon Elements AR软件）快速获取时间序列图像。

4. [Ca²⁺]_i的比率测量

1. [Ca²⁺]i 在分离的淋巴管平滑肌中的浓度通过 Ca²⁺-感应染料Fura 2-乙酰甲氧基酯（AM）（Molecular Probes，Eugene，OR）。
2. 用含有 Fura-2 AM 的 APSS 溶液替换浴液，使淋巴管负载 Fura-2 AM2 μM）和0.2%（重量/体积）的泊洛沙姆酸，30分钟 37 °C.
3. 30分钟后将灌流液换回APSS溶液。冲洗2次，以清除浴液中的Fura-2。将组织浴槽静置，至少平衡20分钟，再进行[Ca²⁺]_i 测量以允许自发性收缩的重新建立。
4. 在分离的淋巴管中采集比例式 Fura-2 测量数据，采用交替激发 340 nm 和 380 nm 波长的采集方案，每次激发持续 50 ms。荧光信号穿过二向色镜（400 nm；Chroma Technology Corp. 400DCLP）和宽带发射滤光片（510 nm，80 nm 带宽；Chroma Technology Corp. D510/80m），由 Photometrics HQ 探测器采集² 相机。我们在2 cm H₂O的基础管腔压力下采集2分钟的数据。₂O 和在 +2、+4、+6、+8 和 +10 cm H₂O 的阶跃增加期间₂O.
5. 为了分析平均[Ca²⁺]_i，绘制一个包含整个淋巴管及其周围区域的兴趣区域（ROI），以确保在淋巴管舒张和收缩过程中能够被完整追踪（图2）。如果视野中包含微吸管，则不应将这些区域纳入ROI。也可以选择较小的ROI，但小ROI可能存在一个问题：当淋巴管收缩和舒张时，管壁可能在纵向上发生轻微移动，从而移出ROI范围。另一个潜在问题是某些淋巴管在收缩过程中会发生扭转，这类淋巴管不应用于研究。通常通过限制离体淋巴管的长度来避免扭转运动 <1 mm。此外，有时瓣膜两侧的管段在收缩/舒张时不同步。在此情况下，由于这些管段代表了独立的功能性淋巴管节段，应仅在瓣膜的一侧进行研究，或在瓣膜两侧分别设置感兴趣区域（ROI）对每个淋巴管节段单独分析。使用10倍物镜时，管壁在相位性收缩过程中应保持在焦范围内；然而，若在收缩过程中部分管壁超出焦距范围，则这些区域不应纳入ROI。还需设置一个背景ROI，应将其放置在远离血管的位置（例如图像的角落）。340/380比值的升高表明[Ca²⁺]的升高。²⁺]_i在不同时间点，可使用软件的测量功能或通过随时间追踪血管壁来测量管腔直径（见第6节）。

5. 压力控制方案

1. 为了在不受施加流速影响的情况下研究压力，必须通过伺服零点反馈泵向每根微移液管施加相同的压力。每根微移液管的管路通过T型连接器连接至安装在泵上的共用管路。初始时将管腔内压力设定为2 cm H₂O₂孵育45-60分钟，足以使淋巴管产生自发性收缩。
2. 仅使用在平衡期内符合以下标准的血管进行研究：（1）血管在2 cm H₂O，（2）血管表现出规律的自发性收缩，且在整个血管长度上收缩程度相对均匀。通常，瓣膜下游区域的收缩程度较血管其他部分更强，只要观察到血管其余部分仍存在收缩活动，此类血管即可用于实验。
3. 在压力阶跃过程中记录快速时间序列图像。每次实验的压力起始值均为 2 cm H₂O 持续 30 秒，然后以 +2、+4、+6、+8 或 +10 cm H₂O 的幅度逐步升高₂O 持续一分钟，然后重新降至 2 cm H₂O 持续 30 秒。
4. 完成压力梯度步骤后，将灌流液更换为含钙溶液²⁺无APSS 37 °C 用于测量最大被动直径（MaxD）和 Ca²⁺-在上述每种管腔压力下进行荧光测量。最大值D 用于计算张力并校正不同大小淋巴管之间的数据。

6. 淋巴管收缩参数

1. 随时间变化的血管直径可通过大多数图像分析软件包中的目标追踪工具来确定。该方法可仅使用一个通道完成（我们使用340 nm通道，但380 nm通道也可适用）。对图像序列应用对比度阈值，使血管壁得以凸显，随后绘制包含每侧血管壁的感兴趣区域（ROI），以实现对血管壁随时间变化的追踪（图3）A）。可通过测量每侧管壁的质心并计算两个质心之间的距离，再减去每侧管壁厚度的一半，来确定内径。
   当由于管腔区域信号较强而难以追踪每个管壁时，第二种选择是测量外径，并基于对血管壁的静态测量结果使用校正因子来推算内径。在此情况下，ROI 覆盖整个血管，追踪外径（图3）B）。该方法也可用于确定淋巴管整个可见的横截面积（图3C由于淋巴管单元具有典型的形态结构，与仅测量血管某一部位的直径相比，该方法能更准确地估算每次收缩时泵出液体的实际体积。
2. 从延时研究中确定以下淋巴管管腔直径测量参数^4,12,13:
   收缩频率（CF），通过计算每分钟的时相性收缩次数来确定。
   舒张末期内径（EDD），即在相位性收缩发生前的直径。
   收缩末期内径（ESD），即心动周期收缩相结束时的内径。
   收缩幅度（AMP = EDD - ESD），作为每搏输出量的简化指标。
   各压力下的最大被动直径（MaxD；在 Ca 中测定²⁺无外加负荷条件）可用于测定淋巴管平滑肌产生的张力，也可用于对不同管径的淋巴管之间，或同一淋巴管在不同管腔压力下所获得的数据进行标准化处理。
   EDD₁ ，即压力阶跃后首次收缩相关的EDD。该值在确定淋巴管对管腔压力阶跃性升高所产生的肌源性收缩时，被用作起始点⁵.
   压力阶跃后孤立淋巴管的肌源性收缩通过管径归一化变化来表示，即压力阶跃升高后的EDD变化率 = 100*(EDD - EDD₁)/MaxD.
   可计算的其他变量，但将在别处详细讨论⁴ 是：
   Tone = 100 * (MaxD EDD)/MaxD，标准化的AMP = AMP/最大值D
   每搏输出量指数（SVI）= π(EDD² - 内镜黏膜下剥离术²)
   射血分数（EF）= 每搏输出量指数（SVI）/(π×舒张末期直径²)
   体积流量指数（VFI）= CF × SVI。

7. 代表性结果：

每次相位性收缩开始时，[Ca²⁺]_i （图4）。此外，在管腔压力阶跃升高后，Ca²⁺振荡的频率²⁺ 瞬时性收缩与时相性收缩同步增加。这些观察结果与先前利用安装在张力传感器上的胸导管所获得的发现相似。¹⁴ 并支持先前数据，表明振荡性 Ca²⁺ 相位性收缩周期机制中来自内部储存的释放¹⁵.

我们还研究了[Ca²⁺]_i 舒张期（在 Ca 之间）²⁺ 瞬时反应和时相性收缩）与施加压力阶跃升高时由牵张引起的淋巴管张力和肌源性收缩相关（图5）。在压力阶跃升高+4 cm H₂O后立即出现₂O 及更高，[Ca²⁺]_i 在舒张期，与压力阶跃前的基线相比，直径持续增加（图5B）。此外，在压力阶跃导致直径初始增加后（EDD₁），出现了肌源性收缩（图5C），定义为EDD从EDD减小₁ 在以往的报告中^5,12在比较不同压力梯度下EDD的平均标准化变化时，+8 和 +10 cm H₂O 压力升高后的收缩程度显著更大₂O 与 +2 cm H₂O 相比₂O（图6A). 胞内[Ca²⁺]_i 也与压力相关，其阶跃式增加分别为 +6、+8 和 +10 cm H₂O 引起 Ca 的显著更高变化²⁺ 高于 +2 cm H₂O₂O（图6B）。然而，压力阶跃-Ca²⁺ 关系在这些压力下似乎也趋于平稳。这些结果表明，Ca²⁺依赖性机制与淋巴管肌源性收缩对牵张的响应相关。然而，压力阶跃-钙²⁺ 关系提示了一种增加Ca的机制²⁺ 敏感性也可能有助于在较高压力梯度下增强的肌源性收缩。

图 1. 用于测量离体淋巴管内 [Ca²⁺]_i 的显微镜系统示意图。离体淋巴管腔置于倒置显微镜的载物台上。样品依次以 340 nm 和 380 nm 波长激发，淋巴管发出的荧光信号由 CCD 相机采集并储存于个人计算机中。淋巴管内的管腔压力由伺服零点反馈系统控制。用户设定系统所需压力，与淋巴管串联的压力传感器将管腔内压力信息传递给反馈系统，后者可通过泵动态调节压力的升高或降低。

图 2. 在分离的淋巴管中进行 Fura-2 比值成像研究时，感兴趣区域（ROI）选择的示例。所选区域包括管腔的大部分（排除接触微移液管的区域）以及周围区域，以确保在整个时间过程中对管腔进行追踪。同时使用一个背景 ROI（右上角）以消除周围灌流液中的非特异性信号。

图 3. 追踪淋巴管泵功能的方法。A. 可通过追踪血管壁运动的感兴趣区域（ROI），随时间测定内径。B. 当对比度阈值设置为包含整个血管时，可使用单个ROI追踪外径。通过校正管壁厚度，可由这些测量值估算内径。C. 另一种方法是追踪血管所包围的面积，结合管壁厚度校正并假设淋巴管呈圆柱形几何结构，可据此计算体积。

图4. [Ca²⁺]_i 与淋巴管直径之间的关系。A. 分离淋巴管中Fura-2荧光强度（热图格式）的延时视频代表性图像。每张图像中的箭头标示出血管的外径。图像1显示舒张期的淋巴管，此时[Ca²⁺]_i相对较低。在图像2中，血管壁的340/380比值强度增加，紧接其后的是图像3-5中发生的节律性收缩。到图像4时，Ca²⁺瞬变已结束，至图像5时，收缩期结束，血管正恢复至静息状态。B. [Ca²⁺]_i与淋巴管管腔直径的关系图显示，每次节律性收缩之前均出现[Ca²⁺]_i的瞬时升高。

图 5. 淋巴管内钙离子浓度 [Ca²⁺]_i 及其收缩周期对压力阶跃升高的响应变化。图中显示了压力阶跃实验方案（A）、代表 [Ca²⁺]_i 的 340/380 比值数据（B）以及随时间变化的淋巴管直径（C）。A. 基线管腔压力为 2 cm H₂O，随后淋巴管依次接受 +2、+4、+6、+8 和 +10 cm H₂O 的压力阶跃。每次压力阶跃记录之间的间隔时间为 1–2 分钟。每一次压力阶跃均引起 [Ca²⁺]_i 瞬时升高频率（B）和节律性收缩频率（C）的增加。随着管腔压力的逐级升高，淋巴管直径也相应增大；在 +4 至 +10 cm H₂O 的压力阶跃下，EDD 在 EDD1 之后出现初始下降（C），该现象先前被称为淋巴管肌源性收缩。每次压力阶跃后，瞬时事件之间的基础 [Ca²⁺]_i 也出现持续升高（B）。肌源性收缩在较大的压力阶跃下更为显著，然而在 +4 至 +10 cm H₂O 的压力阶跃之间，基础 [Ca²⁺]_i 的升高幅度大致相同（B）。在 +6 至 +10 cm H₂O 的压力阶跃后，还可观察到先前报道过的 AMP 补偿性升高现象（C）。

图6. 压力阶跃后舒张期期间淋巴管肌源性收缩及游离[Ca²⁺]_i的逐步升高。A. 使用EDD₁后30–50秒内的平均EDD来计算每次压力阶跃下归一化EDD的变化。B. EDD₁后30–50秒时340/380比值的强度除以基线期（2 cm H₂O）的平均340/380比值。*P<0.05，与+2 cm H₂O压力阶跃相比。共研究了4条血管。

视频 1. 用于研究的离体淋巴管阶段性收缩示例。管腔压力设定为 2 cm H₂O。底部显示了经过的时间和比例尺。延时图像使用 10X 物镜通过透射光采集。点击此处观看视频。

视频 2. 跳动的离体淋巴管中的比例式 Fura-2 成像。左上角显示热图标尺，底部显示经过的时间和比例尺。压力初始设定为 2 cm H₂O，在 0.5 分钟时升至 8 cm H₂O，并在 1.5 分钟时恢复至 2 cm H₂O。点击此处观看视频。

讨论

采用了一种新颖的方法组合来研究淋巴管的内在泵功能。同时测量泵动淋巴管中[Ca²⁺]_i和管径变化的能力，将有助于研究Ca²⁺依赖性和Ca²⁺敏化信号通路在调控淋巴收缩周期整体机制中的相对作用。

淋巴管的收缩周期由叠加在张力基础上的时相性收缩构成。数据显示，每次时相性收缩均伴随细胞内[Ca²⁺]_i的短暂升高，提示Ca²⁺在起搏机制中起核心作用，且Ca²⁺瞬变的频率对管腔压力的变化敏感。我们的数据还显示，压力的快速升高可引起瞬变间基础[Ca²⁺]_i的持续上升。这种上升可能有助于在管腔压力阶跃升高后，在集合淋巴管中观察到的肌源性收缩。然而，我们观察到，当压力阶跃从+6至+10 cm H₂O变化时，基础[Ca²⁺]_i的升高趋于平台，而此时肌源性收缩的程度各不相同。该数据表明，另一种机制，可能是Ca^2+...