分离收缩性淋巴管中胞质 Ca2+ 的测定

摘要

我们介绍一种评估分离淋巴管中胞质Ca²⁺浓度的方法，用于研究淋巴管平滑肌收缩的Ca²⁺依赖性及Ca²⁺敏感化机制。

摘要

淋巴管构成一个多功能的运输系统，可维持体液稳态，将脂质输送至中心循环，并作为对潜在有害抗原的监视系统，从而优化黏膜免疫和适应性免疫应答¹。淋巴液由进入盲端起始淋巴管的组织间液形成，随后在较大的集合淋巴管中逆压力梯度被运输。每条集合淋巴管由一系列称为淋巴管节的节段构成，节段之间由防止逆流的二叶瓣膜分隔。每个淋巴管节均具有收缩周期，可逆压力梯度将淋巴液推向中心循环²。这种节律性收缩模式类似于心脏周期，具有收缩期和舒张期，但收缩频率较低⁴。此外，淋巴管平滑肌可产生张力，并分别在管腔压力升高和降低时表现出肌源性收缩和舒张⁵。因此，目前提出存在一种支持淋巴管节律性和紧张性收缩的分子机制混合模式。

平滑肌的收缩通常由细胞质内 Ca²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_i）以及收缩元件对细胞周围环境变化所引发的 Ca²⁺ 敏感性共同调节⁶。[Ca²⁺]_i 取决于 Ca²⁺ 通过质膜上的配体门控或电压门控 Ca²⁺ 通道的跨膜移动，以及细胞内储存库中 Ca²⁺ 的释放与再摄取。细胞质中的 Ca²⁺ 与钙调蛋白结合，激活诸如肌球蛋白轻链（MLC）激酶（MLCK）等酶，后者进一步使 MLC 磷酸化，从而引发肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩⁸。然而，该通路对 Ca²⁺ 的敏感性可由 MLC 磷酸酶（MLCP）进行调节⁹。MLCP 的活性受 Rho 激酶（ROCK）和肌球蛋白磷酸酶抑制蛋白 CPI-17 的调控。

此处我们介绍一种用于评估[Ca²⁺]_i 随着时间推移，在分离的灌注淋巴管中研究 Ca²⁺-依赖性和Ca²⁺- 淋巴管平滑肌收缩的致敏机制。利用分离的大鼠肠系膜集合淋巴管，我们研究了牵张诱导的[Ca²⁺]_i 和收缩活动。离体淋巴管模型的优势在于能够严格控制压力、 flow 以及灌流液的化学成分。[Ca²⁺]_i 通过使用比率型 Ca 染料负载淋巴管来确定²⁺-结合染料Fura-2。这些研究将为更广泛地探究调控淋巴平滑肌时相性收缩与紧张性收缩的不同分子机制提供一种新方法。

方案

1. 动物

1. 所有实验程序均经路易斯安那州立大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院指南（NIH出版物第85-12号，1996年修订版）进行。雄性Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories，体重270–350 g）饲养于温度受控的环境中22 °C）以及可控光照（12小时光照/12小时黑暗循环）环境。大鼠到达后，经过为期一周的适应期，期间提供标准大鼠饲料（2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan）和饮水 随意摄取.

2. 实验设置

1. 用于固定淋巴管的玻璃微移液管由含丝硼硅酸盐玻璃制成，外径为1.2 mm，内径为0.69 mm（Sutter Instrument BF 120-69-15）。使用Flaming/Brown微移液管拉制仪（Sutter Instrument P-97型）拉制移液管，并用显微研磨器（Narishige EG 400型）进行斜面打磨，以获得外径约为60 μm的斜面尖端。
2. 将微移液管安装至离体血管灌流腔室（Living Systems公司CH-1型，佛蒙特州伯灵顿）。移液管应匹配电阻（即开口尺寸相同）。
3. 用含白蛋白的生理盐溶液（APSS，见表1）填充腔室（5 mL）和微移液管。确保微移液管和管路中无气泡。

讨论

采用了一种新颖的方法组合来研究淋巴管的内在泵功能。同时测量泵动淋巴管中[Ca²⁺]_i和管径变化的能力，将有助于研究Ca²⁺依赖性和Ca²⁺敏化信号通路在调控淋巴收缩周期整体机制中的相对作用。

淋巴管的收缩周期由叠加在张力基础上的时相性收缩构成。数据显示，每次时相性收缩均伴随细胞内[Ca²⁺]_i的短暂升高，提示Ca²⁺在起搏机制中起核心作用，且Ca²⁺瞬变的频率对管腔压力的变化敏感。我们的数据还显示，压力的快速升高可引起瞬变间基础[Ca²⁺]_i的持续上升。这种上升可能有助于在管腔压力阶跃升高后，在集合淋巴管中观察到的肌源性收缩。然而，我们观察到，当压力阶跃从+6至+10 cm H₂O变化时，基础[Ca²⁺]_i的升高趋于平台，而此时肌源性收缩的程度各不相同。该数据表明，另一种机制，可能是Ca^2+.......