小鼠浅表淋巴结手术

摘要

为了在同一只小鼠体内随时间追踪免疫反应的进程，可以通过手术依次切除淋巴结。本文将描述如何实施该技术。

摘要

在免疫学领域，为了理解机体对疫苗、感染或肿瘤产生的免疫应答进程，通常需要进行时间序列追踪研究。同样，淋巴细胞稳态的研究也需要开展时间过程实验。在同一只小鼠体内进行此类研究，可最大限度地减少实验变异性和使用的小鼠数量，是理想的选择。通过采血可实现时间序列实验，但仅能获取循环淋巴细胞的信息，且细胞数量有限^1-4。由于在体内循环和驻留于淋巴结中的淋巴细胞具有不同的特性，因此对这两个部位的检测均十分重要。通过手术依次摘除淋巴结，为在同一只小鼠体内长期追踪免疫应答或免疫细胞扩增提供了独特的机会。此外，该技术每次可获得每枚淋巴结约1-2×10⁶个细胞，足以进行表型鉴定和/或功能分析。我们及其他研究者已成功应用过连续淋巴结手术（又称连续淋巴结切除术）^5-11。本文中，我们描述了如何通过对麻醉小鼠皮肤做微小切口，摘除腋窝和腹股沟淋巴结。由于手术操作表浅且迅速，小鼠恢复快，愈合良好，且无明显疼痛。每隔一天即可采集一枚或两枚淋巴结，从而实现时间序列实验。因此，该技术适用于长期研究驻留于淋巴结的淋巴细胞的特征。该方法可适用于多种实验设计，我们相信许多实验室都将从开展连续淋巴结手术中获益。

方案

1. 手术前准备

小鼠的处理遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。

1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（150/300 mg/kg，i.p.）或吸入异氟烷（2%，1L 氧气）使小鼠麻醉。如有条件，应优先使用异氟烷，因其可更好地控制麻醉的时间和深度。同时，异氟烷麻醉过程中可同步给予氧气，有助于维持动物的生理功能。此外，异氟烷可直接经肺部排出，无需经肝脏或肾脏代谢。
2. 皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）或其他镇痛剂。
3. 手术前在小鼠眼部涂抹眼膏，以防止角膜干燥（若使用异氟烷麻醉时）。
4. 通过轻捏小鼠足爪及轻滚其尾巴来确认其是否已进入麻醉状态。若小鼠无反应，即可开始手术。

2. 手术操作

可以通过手术切除4个浅表淋巴结（LN）：双侧腹股沟淋巴结和双侧腋下淋巴结。在年轻瘦小的小鼠（6–8周龄）中，淋巴结的分离更为容易，因为年老小鼠体内脂肪组织的存在可能干扰淋巴结的分离。然而，通过反复练习可以克服这一限制。为了小鼠的舒适，我们每次最多只采集2个淋巴结；在进行时间进程实验时，每隔一天采集一次淋巴结。此外，虽然可给予小鼠抗生素以预防感染，但我们并未使用，且伤口愈合情况良好。需要注意的是，根据实验设计的不同，使用抗生素可能会影响所观察到的结果（例如在检测对细菌的免疫反应时）。请注意，所有器械在每次使用后均需灭菌，并在整个操作过程中保持无菌条件。

1. 将小鼠侧放。
2. 根据需要采集的淋巴结位置，确定切口区域。（图1）。
3. 对该区域使用氯己定或其他消毒剂进行消毒。
4. 用锋利的剪刀在前肢背部或靠近腹部的后足上方做一个微小切口（约5 mm）。（图1）。
5. 用镊子清除已剪断的松散毛发。如需要，可在切口前先剃毛。然而，该步骤会延长操作时间，且我们发现并无必要，因为如本方法所示，剃毛并不能改善愈合或降低感染率，而这两者本身已极为罕见。
6. 用两把镊子将切口拉开，以便观察淋巴结。切口可延展至10 mm。淋巴结颜色呈灰暗或比周围脂肪组织更深。
7. 用一把镊子夹住覆盖在淋巴结上方脂肪和组织表面的筋膜（一层薄薄的膜状结构），轻轻牵拉，避免破坏周围组织。
8. 将第二把镊子尽可能深入地置于淋巴结下方。用第一把镊子撕开筋膜并取出淋巴结。若成功采集淋巴结，原淋巴结所在位置应出现少量出血痕迹。请注意，淋巴结在等渗溶液中会下沉。这一简单测试可帮助确认所取组织为淋巴结而非脂肪组织。
9. 检查伤口内是否残留毛发。
10. 将皮肤两侧内面贴合，然后用夹子固定闭合切口。我们使用Michel夹及配套施夹镊进行操作。根据切口大小安装一个或两个夹子。大多数情况下，组织愈合后夹子会自行脱落。

3. 术后护理

1. 在笼子底部添加一些湿粮，以便小鼠在手术后能够容易进食。
2. 手术后约6至8小时，检查小鼠以确保其无疼痛表现。仔细观察其行为（姿势、步态、与同类的互动以及毛发外观）。若小鼠整体状态不佳，应给予第二剂丁丙诺啡。小鼠应在次日恢复正常的活动行为，否则应继续给予丁丙诺啡。小鼠绝不可达到动物护理委员会先前确定并批准的终点标准。如有需要，可向动物饲养管理人员寻求建议和帮助。

4. 淋巴结处理

1. 在实验室中，为获得单细胞悬液，按照常规操作解离淋巴结。我们将淋巴结压在磨砂载玻片上，通常可从每个淋巴结获得 1-2 × 10⁶ 个细胞。或者，也可将淋巴结用于RNA提取的准备工作。
2. 按照常规实验方案对细胞进行染色。应获得预期的淋巴结流式细胞术分析图谱。

5. 代表性结果

通过手术从麻醉小鼠或处死小鼠中获取的淋巴结，其前向散射与侧向散射图例如图2所示。活淋巴细胞门内的细胞分布特征及其百分比相同，表明淋巴结手术是一种合适的细胞收获技术。

图1. 小鼠腹股沟淋巴结和臂淋巴结的定位。A. 腹股沟淋巴结位于后肢足部上方，略偏向腹部方向。B. 臂淋巴结位于前肢后方。

图 2. 淋巴结手术后获得的淋巴细胞流式细胞术分析图谱。图中显示了通过手术从麻醉小鼠（A）或处死小鼠（B）获取的淋巴结细胞的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图谱。淋巴结经分离、解离后，使用流式细胞仪进行分析。图中所示为活淋巴细胞门内细胞所占的百分比。

讨论

我们描述了一种可用于多种实验系统的淋巴结手术方案。尽管该技术在追踪免疫应答或免疫细胞稳态方面非常有用，但仍存在一些局限性。首先，仅能获取四个淋巴结。其次，所研究的免疫应答必须是全身性的，或发生在浅表腹股沟或臂部（引流皮肤的）淋巴结中。最后，所获取细胞的数量受淋巴结摘除质量的影响，这一技术性限制在需要绝对细胞数时可能导致实验结果的变异性。然而，当不同实验条件下淋巴结大小无显著差异时，目标细胞所占百分比本身即可提供相关且准确的信息。幸运的是，一旦该技术被熟练掌握，淋巴结摘除的质量将显著提高，从而在每个淋巴结中获得高度可重复的细胞数量。我们认为，尽管存在上述局限性，淋巴结手术在研究免疫应答进程方面仍具有关键优势。首先，可在同一只小鼠中动态追踪免疫应答随时间的变化，从而降低实验变异性并减少使用的小鼠数量。其次，可直接研究发生在淋巴结中的事件，例如淋巴细胞稳态或免疫应答的启动。另一主要优势是，从淋巴结中回收的细胞数量多于血液，从而支持更深入的细胞表征分析。该技术也适用于其他目的，例如对转基因小鼠进行基因分型，或研究驻留于淋巴结或经淋巴结迁移的其他细胞群体，如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Graefe 细纹优质镊子	Harvard Apparatus	52-2144	强弯曲，10 厘米（4 英寸），0.8 毫米尖端
Michel 夹施加与移除镊子	Harvard Apparatus	52-3779	12.5 厘米（5 英寸）
Michel 夹 100	Harvard Apparatus	52-3746	7.5-1.75 毫米
镇痛新（盐酸丁丙诺啡）	Merck & Co.
维他灵（盐酸氯胺酮）	Bioniche Animal Health		DIN: 01989529
赛拉嗪（赛拉嗪）	Bayer AG		DIN: 02169592
异氟烷	Abbott Laboratories		DIN: 02032384
低渗泪眼膏	Novartis AG		DIN: 02133288
百克建（2% 葡萄糖酸氯己定与 70% 异丙醇）	Omega Engineering, Inc.	L0000017	DIN: 02251477