为了在同一只小鼠体内随时间追踪免疫反应的进程，可以通过手术依次切除淋巴结。本文将描述如何实施该技术。
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本文内容
摘要
摘要
在免疫学领域，为了理解机体对疫苗、感染或肿瘤产生的免疫应答进程，通常需要进行时间序列追踪研究。同样，淋巴细胞稳态的研究也需要开展时间过程实验。在同一只小鼠体内进行此类研究，可最大限度地减少实验变异性和使用的小鼠数量，是理想的选择。通过采血可实现时间序列实验，但仅能获取循环淋巴细胞的信息，且细胞数量有限1-4。由于在体内循环和驻留于淋巴结中的淋巴细胞具有不同的特性，因此对这两个部位的检测均十分重要。通过手术依次摘除淋巴结，为在同一只小鼠体内长期追踪免疫应答或免疫细胞扩增提供了独特的机会。此外，该技术每次可获得每枚淋巴结约1-2×106个细胞，足以进行表型鉴定和/或功能分析。我们及其他研究者已成功应用过连续淋巴结手术（又称连续淋巴结切除术）5-11。本文中，我们描述了如何通过对麻醉小鼠皮肤做微小切口，摘除腋窝和腹股沟淋巴结。由于手术操作表浅且迅速，小鼠恢复快，愈合良好，且无明显疼痛。每隔一天即可采集一枚或两枚淋巴结，从而实现时间序列实验。因此，该技术适用于长期研究驻留于淋巴结的淋巴细胞的特征。该方法可适用于多种实验设计，我们相信许多实验室都将从开展连续淋巴结手术中获益。
方案
1. 手术前准备
小鼠的处理遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。
- 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（150/300 mg/kg，i.p.）或吸入异氟烷（2%，1L 氧气）使小鼠麻醉。如有条件，应优先使用异氟烷，因其可更好地控制麻醉时间和深度。同时，给予氧气可支持动物的生理功能。此外，异氟烷可直接经肺部排出，无需经肝脏或肾脏代谢。
- 皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）或其他镇痛剂。
- 手术前在小鼠眼部涂抹眼膏，以防止眼睛干燥（若使用异氟烷麻醉时）。
- 通过轻捏小鼠足爪并轻卷其尾巴来确认其是否已进入麻醉状态。若小鼠无反应，即可开始手术。
2. 手术操作
可通过手术切除4个浅表淋巴结（LN）：双侧腹股沟淋巴结和双侧腋下淋巴结。在年轻瘦小的小鼠（6–8周龄）中，淋巴结的分离更为容易，因为较年长小鼠体内脂肪组织的存在可能干扰淋巴结的分离。然而，通过反复练习可克服这一限制。为了小鼠的舒适，我们每次最多只采集2个淋巴结；在进行时间进程实验时，每隔一天采集一次淋巴结。此外，为预防感染，可给予小鼠抗生素，但我们并未使用，伤口仍可正常愈合。需要注意的是，根据实验设计的不同，使用抗生素可能影响所观察到的结果（例如在检测对细菌的免疫反应时）。请注意，所有器械在每次使用后均需灭菌，并在整个操作....
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讨论
我们描述了一种可用于多种实验系统的淋巴结手术方案。尽管该技术在追踪免疫应答或免疫细胞稳态方面非常有用，但仍存在一些局限性。首先，仅能获取四个淋巴结。其次，所研究的免疫应答必须是全身性的，或发生在浅表腹股沟或臂部（引流皮肤的）淋巴结中。最后，所获取细胞的数量受淋巴结摘除质量的影响，这一技术性限制在需要绝对细胞数时可能导致实验结果的变异性。然而，当不同实验条件下淋巴结大小无显著差异时，目标细胞所占百分比本身即可提供相关且准确的信息。幸运的是，一旦该技术被熟练掌握，淋巴结摘除的质量将显著提高，从而在每个淋巴结中获得高度可重复的细胞数量。我们认为，尽管存在上述局限性，淋巴结手术在研究免疫应答进程方面仍具有关键优势。首先，可在同一只小鼠中动态追踪免疫应答随时间的变化，从而降低实验变异性并减少使用的小鼠数量。其次，可直接研究发生在淋巴结中的事件，例如淋巴细胞稳态或免疫应答的启动。另一主要优势是，从淋巴结中回收的细胞数量多于血液，从而支持更深入的细胞表征分析。该技术也适用于其他目的，例如对转基因小鼠进行基因分型，或研究驻留于淋巴结或经淋巴结迁移的其他细胞群体，如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞。
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致谢
感谢Sylvie Lesage及实验室所有成员对本方案的审阅。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP-77545）的支持。Nathalie Labrecque获得魁北克健康研究基金会（FRSQ）高级学者奖学金，Mélissa Mathieu获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）亚历山大·格拉汉姆·贝尔加拿大研究生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Graefe 细纹优质镊子 | Harvard Apparatus | 52-2144 | 强弯曲，10 厘米（4 英寸），0.8 毫米尖端 |
| Michel 夹施加与移除镊子 | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 厘米（5 英寸） |
| Michel 夹 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 毫米 |
| 镇痛新（盐酸丁丙诺啡） | Merck & Co. | ||
| 维他灵（盐酸氯胺酮） | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| 赛拉嗪（赛拉嗪） | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| 异氟烷 | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| 低渗泪眼膏 | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| 百克建（2% 葡萄糖酸氯己定与 70% 异丙醇） | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
参考文献
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zho....
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重印与许可
