扩增与检测表达绿色荧光蛋白的传染性绵羊梅迪-维斯纳病毒分子克隆

摘要

我们描述了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）且具有完全感染性的绵羊肺炎病毒（maedi-visna virus）的分子克隆。该病毒的复制可通过荧光显微镜和流式细胞术进行检测。

摘要

绵羊肺腺瘤病毒（Maedi-visna virus，MVV）是一种感染绵羊的慢病毒，可导致缓慢进展的间质性肺炎和脑炎¹。体内条件下，MVV的主要靶细胞被认为是单核细胞系来源的细胞²。然而，某些MVV毒株也能在其他类型的细胞中复制^3,4。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是研究活细胞中慢病毒感染的常用标记物。我们已将egfp基因插入MVV的dUTPase基因中。dUTPase基因在大多数绵羊和山羊的慢病毒毒株中高度保守，并已被证明在山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）的复制中具有重要作用⁵。然而，已有研究表明，在本研究使用的MVV分子克隆中，dUTPase在体外和体内均非复制所必需⁶。MVV的复制严格局限于绵羊或山羊来源的细胞。我们使用一种源自绵羊脉络丛的原代细胞系（SCP细胞）进行病毒的转染与扩增⁷。该表达荧光的MVV具有完全感染性，且EGFP的表达在连续传代至少6代后仍保持稳定⁸。TCID₅₀测定结果与EGFP信号之间具有良好的相关性。因此，该病毒可用于体外和体内研究中快速检测感染细胞，适用于细胞嗜性及致病性相关研究⁸。

方案

1. 转染

该分子克隆包含在两个质粒中，分别为12 kb的p8XSp5-egfp和4.5 kb的p67r。^9,10

1. 用XbaI酶切等摩尔量的两种质粒，即4.4 μg的p8XSp5-egfp和1.6 μg的p67r，酶切后进行连接，再转染。
2. 连接反应中使用1 Weiss单位的连接酶，总体积为50 μl，于16°C过夜孵育。
3. 连接完成后，将连接产物于65°C孵育15分钟以灭活连接酶。此步骤可省略。
4. 转染前两天，将10⁶个SCP细胞接种于T25组织培养瓶中，在5 ml DMEM + 10%小羊血清和2 mM谷氨酰胺（不加抗生素）中培养两天，直至细胞融合度达到90%的单层。若两天后细胞融合度未达90%，可继续培养一天。

注意：羔羊血清可用胎牛血清（FBS）替代。我们常规使用羔羊血清，因为某些MVV毒株会被FBS抑制；然而，该MVV毒株不受FBS抑制。

5. 当细胞准备进行转染时，更换培养基为含1%血清（小羊血清或FBS）但不含抗生素的DMEM。
   我们使用Lipofectamin 2000（Invitrogen）进行转染。
6. 将DNA稀释于500μl Opti-MEM培养基中。
7. 将20μl Lipofe....

讨论

本文所展示的表达GFP的MVV分子克隆，将有助于在体外和体内分析MVV与宿主细胞的相互作用及其致病性。病毒在复制7-14天后无疑会因逆转录酶的不准确性而积累一些突变。然而，该克隆作为单周期载体的使用存在局限性。其一，该克隆的应用仅限于绵羊和山羊来源的细胞。使用我们的构建体转染这些细胞的效率仅为5-15%，而使用pEGFP-N3载体时转染效率为15-20%，相比之下，293-T细胞的转染效率则超过90%。293-T细胞曾被测试作为MVV载体的包装细胞，但所产生的病毒颗粒在绵羊细胞和293-T细胞中均无感染性¹²，这可能是由于尚未明确的限制性因子所致。该感染性克隆由两个质粒组成，这是另一项不足之处。这主要是因为全长克隆在大肠杆菌（E. coli）中不稳定。然而，将其全长克隆构建至低拷贝质粒中应是可行的。

质粒和细胞可向作者索取。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO，隶属于 Life Technologies	10938025
Opti-MEM	GIBCO，隶属于 Life Technologies	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019