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扩增与检测表达绿色荧光蛋白的传染性绵羊梅迪-维斯纳病毒分子克隆

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DOI：

10.3791/3483

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2011年10月9日

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

本文内容

摘要

我们描述了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）且具有完全感染性的绵羊肺炎病毒（maedi-visna virus）的分子克隆。该病毒的复制可通过荧光显微镜和流式细胞术进行检测。

摘要

绵羊肺腺瘤病毒（Maedi-visna virus，MVV）是一种感染绵羊的慢病毒，可导致缓慢进展的间质性肺炎和脑炎1。体内条件下，MVV的主要靶细胞被认为是单核细胞系来源的细胞2。然而，某些MVV毒株也能在其他类型的细胞中复制3,4。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是研究活细胞中慢病毒感染的常用标记物。我们已将egfp基因插入MVV的dUTPase基因中。dUTPase基因在大多数绵羊和山羊的慢病毒毒株中高度保守，并已被证明在山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）的复制中具有重要作用5。然而，已有研究表明，在本研究使用的MVV分子克隆中，dUTPase在体外和体内均非复制所必需6。MVV的复制严格局限于绵羊或山羊来源的细胞。我们使用一种源自绵羊脉络丛的原代细胞系（SCP细胞）进行病毒的转染与扩增7。该表达荧光的MVV具有完全感染性，且EGFP的表达在连续传代至少6代后仍保持稳定8。TCID50测定结果与EGFP信号之间具有良好的相关性。因此，该病毒可用于体外和体内研究中快速检测感染细胞，适用于细胞嗜性及致病性相关研究8。

方案

1. 转染

该分子克隆包含在两个质粒中，分别为12 kb的p8XSp5-egfp和4.5 kb的p67r。9,10

  1. 用XbaI酶切等摩尔量的两种质粒，即4.4 μg的p8XSp5-egfp和1.6 μg的p67r，酶切后进行连接，再进行转染。
  2. 连接反应中使用1 Weiss单位的连接酶，总体积为50 μl，于16°C过夜孵育。
  3. 连接完成后，将连接产物于65°C孵育15分钟以灭活连接酶。此步骤可省略。
  4. 转染前两天，将106个SCP细胞接种于T25组织培养瓶中，在5 ml DMEM培养基（含10%小羊血清和2 mM谷氨酰胺，不含抗生素）中培养两天，直至细胞融合度达到90%的单层。若两天后细胞融合度未达90%，可继续培养一天。

注意：羔羊血清可由胎牛血清（FBS）替代。我们常规使用羔羊血清，因为某些MVV毒株会被FBS抑制；然而，该MVV毒株不受FBS抑制。

  1. 当细胞准备进行转染时，更换培养基为含1%血清（小羊血清或FBS）但不含抗生素的DMEM。
    我们使用Lipofectamin 2000（Invitrogen）进行转染。
  2. 将DNA稀释于500μl Opti-MEM培养基中。
  3. 将20μl Lipofectamin 2000稀释于500μl Opti-MEM培养基中，室温（RT）静置5分钟。
  4. 5分钟孵育后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 2000混合（总体积 = 1000 μl）。轻轻混匀，并在室温下孵育20–30分钟。
  5. 将转染混合物（1 ml）加入含有SCP细胞和培养基（5 ml）的T25培养瓶中。通过轻轻摇晃混匀。
  6. 在37°C、5% CO2条件下过夜孵育（18–24小时）。
  7. 次日更换培养基为含1%血清、2mM谷氨酰胺、100IU青霉素和100IU链霉素的DMEM。
  8. 通过倒置荧光显微镜观察SCP细胞中GFP的表达情况。这些原代细胞的转染效率通常较低，约为5–15%。
  9. 继续在37°C、5% CO2条件下孵育数天，以使病毒在培养瓶中扩散。完全感染通常需要7–14天。
  10. 通过将上清液分装至Eppendorf管中收集病毒。在微量离心机中以3000 rpm离心5分钟，去除细胞碎片。将含有病毒的上清液转移至新管中。于-80°C保存。

2. 病毒滴定

  1. 在96孔板中每孔加入100 μl含10%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基，接种3×104个SCP细胞。于37°C、5% CO2条件下培养。
  2. 若次日细胞达到汇合状态，则更换培养基为每孔100 μl含1%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基。
  3. 按以下方式稀释病毒：
    1. 在96孔圆底或V型底板中，向4 × 10个孔每孔加入180 μl含1%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基。
    2. 进行四重复的十倍系列稀释：向平板第一列的4个孔中各加入20 μl病毒，使用多通道移液器反复吹打混匀。更换移液器吸头后，将20 μl液体转移至下一列的4个孔，依此类推。最后一列孔不加病毒，作为空白对照。
  4. 向SCP细胞及培养基中每孔加入100 μl病毒稀释液。
  5. 于37°C、5% CO2条件下培养。连续观察两周GFP荧光及细胞病变效应。
    细胞病变效应表现为细胞变圆、透明度降低（与正常细胞相比），并可见突起延伸，最终出现多核细胞及细胞死亡。
  6. 采用Reed-Muench法11计算病毒滴度（TCID50）。

3. 感染细胞的流式细胞术分析

注意：为了快速监测病毒的复制情况，可通过流式细胞术检测感染的细胞。

  1. 用胰蛋白酶处理感染的细胞（约105），用PBS洗涤1次，再重悬于500 μl PBS中。
  2. 加入500 μl 4%多聚甲醛溶液（终浓度为2%），室温孵育30分钟。
  3. 在微型离心机中以3000 rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。
  4. 用PBS洗涤2次，每次5分钟，然后在FACScan分析仪上进行分析。计数10,000个事件。

4. 代表性结果：

该病毒应具有完全感染性，并能复制至 106 – 107 TCID50/ml 的滴度。感染的细胞具有荧光，可通过流式细胞术和荧光显微镜检测。通常，使用流式细胞术可在感染细胞培养物中检测到超过 60% 的细胞表达 GFP（图 1）。同样，通过荧光显微镜观察时，大多数细胞均呈荧光阳性（图 2A 和 B）。

流式细胞术散点图；GFP表达分析；细胞群体分化。
图1. SCP细胞感染KV1772-egfp病毒7天后的FACScan分析结果。

细胞形态学比较；明场（A）与荧光（B）显微成像技术。
图 2. SCP 细胞感染 KV1772-egfp 后经 7 天培养的相差显微镜图像（A）。相同细胞的荧光显微镜观察结果（B）。

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讨论

本文所展示的表达GFP的MVV分子克隆，将有助于在体外和体内分析MVV与宿主细胞的相互作用及其致病性。病毒在复制7-14天后无疑会因逆转录酶的不准确性而积累一些突变。然而，该克隆作为单周期载体的使用存在局限性。其一，该克隆的应用仅限于绵羊和山羊来源的细胞。使用我们的构建体转染这些细胞的效率仅为5-15%，而使用pEGFP-N3载体时转染效率为15-20%，相比之下，293-T细胞的转染效率则超过90%。293-T细胞曾被测试作为MVV载体的包装细胞，但所产生的病毒颗粒在绵羊细胞和293-T细胞中均无感染性12，这可能是由于尚未明确的限制性因子所致。该感染性克隆由两个质粒组成，这是另一项不足之处。这主要是因为全长克隆在大肠杆菌（E. coli）中不稳定。然而，将其全长克隆构建至低拷贝质粒中应是可行的。

质粒和细胞可向作者索取。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由冰岛研究基金和冰岛大学研究基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGIBCO，隶属于 Life Technologies10938025
Opti-MEMGIBCO，隶属于 Life Technologies51985018
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019

参考文献

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TCID50

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