本方案旨在从黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中分离具有活性的全长驱动蛋白，用于单分子生物物理研究。我们展示了如何收集胚胎、制备胚胎裂解液，并随后聚合微管（MTs）。通过将驱动蛋白固定在微管上，离心沉淀驱动蛋白-微管复合物，再通过添加ATP将驱动蛋白从微管上释放，从而实现驱动蛋白的纯化。
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摘要
摘要
驱动蛋白沿微管运输货物，并将其转运至特定的亚细胞区域。由于运输功能异常被认为是一系列神经退行性疾病的基础，因此理解基于微管的马达运输及其调控机制，最终可能有助于开发更有效的治疗策略。Kinesin-1 是一种真核生物驱动蛋白，可在三磷酸腺苷（ATP）水解供能的条件下，沿微管（MTs）向正端（anterograde）方向运动。本文报道了一种详细的纯化方案，用于从样本中分离具有活性的全长 kinesin-1 蛋白 果蝇 胚胎，从而允许组合使用 果蝇 将遗传学与单分子生物物理研究相结合。从约50个产卵杯开始，每个产卵杯中约有1000只雌蝇，进行过夜收集，共获得约10 ml紧密堆积的胚胎。胚胎经次氯酸钠溶液去壳处理（获得约9克胚胎），随后进行匀浆。匀浆后，通过低速离心和高速离心对匀浆液进行澄清。将澄清后的上清液用GTP和紫杉醇处理，以促进微管（MTs）聚合。在室温下加入ATP类似物5'-腺苷亚氨二磷酸，使驱动蛋白（kinesin）固定于聚合的微管上。驱动蛋白结合后，通过高速离心经蔗糖垫沉淀微管。将微管沉淀重新悬浮，并重复该过程。最后加入ATP，使驱动蛋白从微管上解离。再次通过高速离心沉淀微管，使驱动蛋白保留在上清液中。将该上清液中的驱动蛋白使用100 KD截留分子量的滤膜进行离心过滤，以进一步纯化，分装后在液氮中速冻，并储存于-80 °C。对纯化后的样品进行SDS凝胶电泳和蛋白质印迹分析。在最终离心过滤步骤前后，使用以下方法评估纯化样品的马达活性： 体外 单分子微管实验。经离心过滤前后的驱动蛋白组分均表现出文献中先前报道的运动持续性。目前正在进行进一步实验，以评估驱动蛋白与其他运输相关蛋白之间的相互作用。
方案
果蝇品系可在实验室中购买并进行扩增。根据所需数量 果蝇 收到培养管后，当培养管达到最大容量时，需频繁“翻转”培养管。扩增持续进行至约50 果蝇 培养瓶装满后，使用100 ml三角烧杯制备“果蝇培养杯”（果蝇培养杯的制备方法将在下一节中讨论）。24小时后，用这些培养杯中的胚胎接种新的培养物 果蝇 底部附有果蝇食物的培养管。在室温条件下，果蝇的生长周期时间为 果蝇 从卵到成蝇的整个发育周期约为8.5天。受精卵在12至15小时后孵化，进入一龄幼虫阶段。幼虫阶段持续约4天，分别在孵化后24小时和48小时经历两次蜕皮，依次发育为二龄和三龄幼虫。随后，幼虫化蛹，形成蛹壳，并经历约4天的变态发育，最终从蛹壳中羽化而出。 1. 继续培养约两到三天以促进更多生长 果蝇 将培养管中的果蝇转移至更多培养管中以增加每管果蝇的数量。当填满400个培养管时，果蝇数量将足够用于五十个产卵杯（每杯约1,000只雌蝇）。果蝇需要时间适应新环境，通常在转移至产卵杯后约两天才能准备就绪用于收集。每日更换琼脂平板可保持果蝇培养杯的清洁，从而延长果蝇寿命。（为进一步理解 果蝇 护理与扩增，请参见 D. B. Roberts 的 果蝇：一种实用方法 2).
获取大量样本的良好来源 果蝇 胚胎是群体培养笼 3，可从商业渠道获得。种群培养笼的组装与维护方法详见该书第5章和第7章 黑腹果蝇细胞与分子生物学中的实际应用4然而，群体培养笼价格昂贵且难以维护。由于群体培养笼可容纳大量果蝇，因此在转移和喂养果蝇时必须使用二氧化碳。如前所述，二氧化碳会降低果蝇的健康状况，导致其产卵能力下降。在小规模实验中，可使用100 ml三角烧杯。利用五十个100 ml烧杯，可获得约9克去壳胚胎。为了去除死亡的果蝇、未使用的酵母糊及其他杂质，我们设计了一种双层筛网捕集装置，其具有不同孔径的筛网。第一层筛网孔径为350微米，用于截留死亡果蝇等不需要的物质，同时允许胚胎通过；第二层筛网孔径为120微米，用于捕获胚胎 果蝇 胚胎及其他杂质将通过筛网。
1. 果蝇培养杯准备与胚胎收集
- 将多个培养瓶中的扩增果蝇翻入一个空的塑料瓶中，直至果蝇堆积高度达到瓶高约一英寸。随后将这些果蝇转移至一个100 ml的产卵收集杯（带尼龙网窗的三口烧杯）。在转移过程中，持续将杯子轻敲硬质表面，以防止果蝇逃逸。用含有酵母糊的琼脂平板封住杯口，静置稳定24–48小时。
- 收集来自五十个果蝇杯的过夜琼脂平板，使用干净的画笔和流动水将平板上的内容物冲洗至筛网捕集器中。用大量水在筛网中冲洗胚胎，直至所有酵母糊被彻底清除。
- 将清洗后的胚胎浸入50%次氯酸钠溶液中3分钟，以去除卵壳。
- 用蒸馏水充分冲洗胚胎，直至无法闻到漂白剂气味。然后将带有胚胎的筛网多次置于C形折叠纸巾上吸干水分。将胚胎转移至一个洁净的离心管中，并记录其重量。
2. 胚胎匀浆与澄清
- 将去壳的胚胎放入Dounce匀浆器中，加入1.5倍体积的预冷提取缓冲液。
- 使用松动的研杵进行5次研磨。将匀浆液分装至洁净的离心管中，在4 °C条件下以15,000 g离心40分钟。
- 小心收集澄清的上清液，避免接触上层白色脂质层或下层沉淀。
- 将上清液转移至洁净的离心管中，在4 °C条件下以50,000 g离心30分钟。
- 按上述方法获得的高速上清液可立即使用，也可迅速冷冻后于-80 °C保存数月。
3. 微管聚合与驱动蛋白结合
- 将冷冻的高速上清液解冻至室温。为聚合微管，加入GTP（0.3 mM）和紫杉醇（20 μM），并在旋转摇床中室温下轻轻振荡20分钟。
- 为结合驱动蛋白，加入2.5 mM不可水解的ATP类似物5'-腺苷亚氨二磷酸（AMPPNP），随后在旋转摇床中室温下振荡10分钟。
4. 微管和驱动蛋白的差速沉降
- 在4 °C条件下，以23,000 g（sw41ti转子，TLS-55）离心30分钟，通过等体积的蔗糖缓冲垫（提取缓冲液中含20%蔗糖和10 μM紫杉醇）沉淀样品。
- 用含有10 μM紫杉醇和75 mM NaCl的提取缓冲液重悬沉淀，体积为原始匀浆体积的10%，进行洗涤。
- 按步骤4.1方法，用另一份等体积的蔗糖缓冲垫重复沉淀步骤。
- 将盐洗后的沉淀重悬于5%提取缓冲液中，缓冲液含20 μM紫杉醇、75 mM NaCl、10 mM MgSO4和10 mM ATP。
- 在4 °C条件下，以120,000 g（sw41ti转子：31,000 rpm，TLS-55：42,000 rpm）离心20分钟。收集上清液（驱动蛋白组分）。
- 在4 °C条件下，以14,000 g离心过滤15分钟。回收浓缩样品，并使用新滤膜按上述条件再次过滤30分钟，收集浓缩样品。
- 进行蛋白质定量分析。简言之，将已知浓度的标准蛋白（牛血清白蛋白；BSA）与一定体积的Bradford试剂混合，测定595 nm波长处的光密度值，绘制光密度-浓度标准曲线，据此计算纯化驱动蛋白组分的未知浓度（该样品在与标准BSA样品相同条件下测得光密度值）。同时，使用已知量的纯化驱动蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western印迹分析。
- 将驱动蛋白组分分装为所需浓度的小体积样品，液氮速冻后于-80 °C保存。
5. 代表性结果
从黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中纯化出全长功能性驱动蛋白。图1显示了银染凝胶图像，展示纯化过程中不同组分的分离情况。第1道为澄清后高速上清液样品（步骤2.5），第2道为澄清后的沉淀样品，第3道为第一次蔗糖垫沉降后的上清液样品（步骤4.1），第4道为第一次沉降后的沉淀样品，第5道为第二次沉降后的上清液样品（步骤4.3），第6道为第二次沉降后的沉淀样品，第7道为最终沉降步骤的沉淀样品（步骤4.5），第8道为纯化的驱动蛋白样品，第9道为经过滤的驱动蛋白样品，第10道为蛋白分子量标记。第8道和第9道中约115 kD处的浓染条带为驱动蛋白重链1，该结果与Saxton于1988年发表的论文5中图1第8道结果一致。图2为使用驱动蛋白重链抗体检测纯化驱动蛋白组分的Western印迹结果。抗体AKINO1-A与其他驱动蛋白家族成员无明显交叉反应6。需注意，尽管本方案可获得具有良好功能活性的驱动蛋白，且该组分中富含驱动蛋白-1，但仍可能存在杂质，包括其他驱动蛋白及其他分子马达蛋白。我们通过过滤去除了多种较小分子量的杂质。至于其他无法仅通过分子大小去除的马达蛋白，本纯化方法与先前研究驱动蛋白所采用的方法相似7，我们认为其中大部分具有活性的马达蛋白为驱动蛋白-1，但更精细的纯化手段可进一步去除潜在的马达蛋白杂质，例如Cole et al8 和 Saxton et al9 所采用的方法。
通过评估驱动蛋白的持续性 体外 单分子微管结合实验，该方法在Scholey所著《运动蛋白动力学实验》一书中进行了更为详细的描述10简而言之，在含有饱和浓度（1 mm）ATP的条件下，将带有单个活性马达蛋白的聚苯乙烯微球与微管接触。马达蛋白结合到微管上，并开始从光镊中心向外移动。当微球相对于光镊中心的位移达到预设值（100 nm）时，激光束功率自动关闭，从而使马达蛋白在无负载条件下沿微管运动。视频显示了一个直径为500 nm、携带单个驱动蛋白（kinesin）沿微管行走的微球。视频画面的长度对应于 20 μm. 图3 代表全长单个分子运动长度的实测分布 果蝇 根据本文所述方案纯化的驱动蛋白分子。对分布进行指数拟合，得到单个驱动蛋白的平均运行长度为1.55 ± 0.1 μm 和 1.28 ± 0.12 μm 分别为过滤和未过滤的样品。
图1. 纯化组分的银染凝胶图：各组分样品在10%凝胶中进行电泳，每泳道上样10 μg蛋白质。泳道1为澄清后高速上清液样品（步骤2.5），泳道2为澄清后沉淀样品，泳道3为蔗糖垫第一次沉降后上清液样品（步骤4.1），泳道4为第一次沉降后沉淀样品，泳道5为第二次沉降后上清液样品（步骤4.3），泳道6为第二次沉降后沉淀样品，泳道7为最终沉降后沉淀样品（步骤4.5），泳道8为纯化的驱动蛋白样品，泳道9为使用100 kD截留分子量的Amicon Ultra 0.5 ml离心滤膜（Millipore, USA）过滤后的驱动蛋白样品。蓝色箭头指示因纯化步骤而减少的蛋白质，红色箭头指示由于本方案中使用的离心过滤步骤导致驱动蛋白浓度升高。
图 2. 纯化的 KHC 组分与抗驱动蛋白抗体杂交：将纯化的驱动蛋白样品进行凝胶电泳，随后转移至硝酸纤维素膜，并在室温下用一抗 AKINO1-A（1:1,000 稀释于 TBST 中）孵育 1 小时，接着在室温下用驴抗兔二抗（1:10,000 稀释于 TBST 中）孵育 1 小时。使用 ECL（化学发光）试剂盒检测上述驱动蛋白信号。
图3. 单个完整长度黑腹果蝇（Drosophila）驱动蛋白的运行长度与速度：（A）和（B）经过滤驱动蛋白样品的运行长度与速度；（C）和（D）未经过滤驱动蛋白样品的运行长度与速度。
图4. 驱动蛋白运动的视频。点击此处观看视频。
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讨论
牛脑是纯化全长驱动蛋白（kinesin）最常用的起始材料11，尽管小鼠脑也已被使用12。使用牛脑作为驱动蛋白来源的一个主要缺点是新鲜起始材料的可获得性：屠宰场通常难以进入，且脑组织必须极为新鲜才能获得有活性的驱动蛋白。此外，只有小牛的脑组织才有效。最后，目前对牛进行遗传操作并不可行，因此只能研究“野生型”蛋白。
小鼠更容易获得，但提取小鼠脑组织相对困难且耗时，因为纯化过程可能需要超过50只小鼠的脑组织。此外，维持小鼠品系的费用也相当高昂。
与牛源或鼠源相比，果蝇具有多项优势。首先，果蝇在实验室中易于培养，所需经费极少，因而容易获得。Drosophila 可产生大量胚胎，这些胚胎可按本文所述方法轻松收集。由于Drosophila基因组可进行遗传操作，且已有大量突变体果蝇易于获取，因此可纯化野生型和突变型蛋白；同时，结合遗传操作与较短的世代周期，能够分离出更多的突变体。然而需要注意的是，由于驱动蛋白功能完全缺失具有致死性，且胚胎中的蛋白主要由母体提供，...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
特别感谢 Kris Ngai 和 Jason Del Rio 在本项目中的支持与协助。本研究由资助号为 GM070676 的 RO1 基金支持，资助对象为 SPG。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂（颗粒状） | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| 右旋葡萄糖（无水 D-葡萄糖） | Fisher Scientific | D16-3 | |
| 培养皿 | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm 规格 （聚酯材质），20 个/袋 |
| Drosophila 培养管 | UCI | ||
| Tricorn 烧杯 | Econo Lab Inc. | B700-100 | 容积：100ml， 尺寸：58x72mm |
| 酵母 | Red Star | 2751 | |
| 尼龙筛网 | Genesee Scientific | 57-102 | 孔径 120 微米 |
| 尼龙筛网 | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| 甘油 | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgSO4（无水） | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin） | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| 抑肽酶（Aprotonin） | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| 紫杉醇（Taxol） | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP 类似物 5’-腺苷亚氨基二磷酸 | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra 离心滤膜：0.5 mL，截留分子量 100 kD，8 个装 | EMD Millipore | UFC510008 |
参考文献
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359(2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109(1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773(1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279(1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138(1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157(1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
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