从Drosophila胚胎中分离与纯化驱动蛋白

摘要

本方案旨在从黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中分离具有活性的全长驱动蛋白，用于单分子生物物理研究。我们展示了如何收集胚胎、制备胚胎裂解液，并随后聚合微管（MTs）。通过将驱动蛋白固定在微管上，离心沉淀驱动蛋白-微管复合物，再通过添加ATP将驱动蛋白从微管上释放，从而实现驱动蛋白的纯化。

摘要

驱动蛋白沿微管运输货物，并将其转运至特定的亚细胞区域。由于运输功能异常被认为是一系列神经退行性疾病的基础，因此理解基于微管的马达运输及其调控机制，最终可能有助于开发更有效的治疗策略。Kinesin-1 是一种真核生物驱动蛋白，可在三磷酸腺苷（ATP）水解供能的条件下，沿微管（MTs）向正端（anterograde）方向运动。本文报道了一种详细的纯化方案，用于从样本中分离具有活性的全长 kinesin-1 蛋白 果蝇 胚胎，从而允许组合使用 果蝇 将遗传学与单分子生物物理研究相结合。从约50个产卵杯开始，每个产卵杯中约有1000只雌蝇，进行过夜收集，共获得约10 ml紧密堆积的胚胎。胚胎经次氯酸钠溶液去壳处理（获得约9克胚胎），随后进行匀浆。匀浆后，通过低速离心和高速离心对匀浆液进行澄清。将澄清后的上清液用GTP和紫杉醇处理，以促进微管（MTs）聚合。在室温下加入ATP类似物5'-腺苷亚氨二磷酸，使驱动蛋白（kinesin）固定于聚合的微管上。驱动蛋白结合后，通过高速离心经蔗糖垫沉淀微管。将微管沉淀重新悬浮，并重复该过程。最后加入ATP，使驱动蛋白从微管上解离。再次通过高速离心沉淀微管，使驱动蛋白保留在上清液中。将该上清液中的驱动蛋白使用100 KD截留分子量的滤膜进行离心过滤，以进一步纯化，分装后在液氮中速冻，并储存于-80 °C。对纯化后的样品进行SDS凝胶电泳和蛋白质印迹分析。在最终离心过滤步骤前后，使用以下方法评估纯化样品的马达活性： 体外 单分子微管实验。经离心过滤前后的驱动蛋白组分均表现出文献中先前报道的运动持续性。目前正在进行进一步实验，以评估驱动蛋白与其他运输相关蛋白之间的相互作用。

方案

果蝇品系可在实验室中购买并进行扩增。根据所需数量 果蝇 收到培养管后，当培养管达到最大容量时，需频繁“翻转”培养管。扩增持续进行至约50 果蝇 培养瓶装满后，使用100 ml三角烧杯制备“果蝇培养杯”（果蝇培养杯的制备方法将在下一节中讨论）。24小时后，用这些培养杯中的胚胎接种新的培养物 果蝇 底部附有果蝇食物的培养管。在室温条件下，果蝇的生长周期时间为 果蝇 从卵到成蝇的整个发育周期约为8.5天。受精卵在12至15小时后孵化，进入一龄幼虫阶段。幼虫阶段持续约4天，分别在孵化后24小时和48小时经历两次蜕皮，依次发育为二龄和三龄幼虫。随后，幼虫化蛹，形成蛹壳，并经历约4天的变态发育，最终从蛹壳中羽化而出。 ¹. 继续培养约两到三天以促进更多生长 果蝇 将培养管中的果蝇转移至更多培养管中以增加每管果蝇的数量。当填满400个培养管时，果蝇数量将足够用于五十个产卵杯（每杯约1,000只雌蝇）。果蝇需要时间适应新环境，通常在转移至产卵杯后约两天才能准备就绪用于收集。每日更换琼脂平板可保持果蝇培养杯的清洁，从而延长果蝇寿命。（为进一步理解 果蝇 护理与扩增，请参见 D. B. Roberts 的 果蝇：一种实用方法 ²).

获取大量样本的良好来源 果蝇 胚胎是群体培养笼 ³，可从....

讨论

牛脑是纯化全长驱动蛋白（kinesin）最常用的起始材料¹¹，尽管小鼠脑也已被使用¹²。使用牛脑作为驱动蛋白来源的一个主要缺点是新鲜起始材料的可获得性：屠宰场通常难以进入，且脑组织必须极为新鲜才能获得有活性的驱动蛋白。此外，只有小牛的脑组织才有效。最后，目前对牛进行遗传操作并不可行，因此只能研究“野生型”蛋白。

小鼠更容易获得，但提取小鼠脑组织相对困难且耗时，因为纯化过程可能需要超过50只小鼠的脑组织。此外，维持小鼠品系的费用也相当高昂。

与牛源或鼠源相比，果蝇具有多项优势。首先，果蝇在实验室中易于培养，所需经费极少，因而容易获得。Drosophila 可产生大量胚胎，这些胚胎可按本文所述方法轻松收集。由于Drosophila基因组可进行遗传操作，且已有大量突变体果蝇易于获取，因此可纯化野生型和突变型蛋白；同时，结合遗传操作与较短的世代周期，能够分离出更多的突变体。然而需要注意的是，由于驱动蛋白功能完全缺失具有致死性，且胚胎中的蛋白主要由母体提供，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂（颗粒状）	Fisher Scientific	1423-500
右旋葡萄糖（无水 D-葡萄糖）	Fisher Scientific	D16-3
培养皿	BD Biosciences	35 1007	60x15mm 规格 （聚酯材质），20 个/袋
Drosophila 培养管	UCI
Tricorn 烧杯	Econo Lab Inc.	B700-100	容积：100ml， 尺寸：58x72mm
酵母	Red Star	2751
尼龙筛网	Genesee Scientific	57-102	孔径 120 微米
尼龙筛网	Small Parts, Inc.	06-350/35
Pipes	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Pipes	Sigma-Aldrich	108321-27-3
甘油	Fisher Scientific	56-81-5
EGTA	Sigma-Aldrich	67-42-5
MgSO4（无水）	Fisher Scientific	7487-88-9
PMSF	Sigma-Aldrich	329-98-6
亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）	Sigma-Aldrich	103476-89-7
抑肽酶（Aprotonin）	Sigma-Aldrich	9087-70-1
TAME	Sigma-Aldrich	178403-8
STI	Calbiochem	65635
GTP	Sigma-Aldrich	36051-31-7
紫杉醇（Taxol）	Sigma-Aldrich	33069-62-4
ATP 类似物 5’-腺苷亚氨基二磷酸	Sigma-Aldrich	3605-31-7
NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7647-14-5
ATP	Sigma-Aldrich	74804-12-9
Amicon Ultra 离心滤膜：0.5 mL，截留分子量 100 kD，8 个装	EMD Millipore	UFC510008