本文描述了一种用于探测活细胞质膜上荧光蛋白在脂筏中分布情况的技术。该技术利用了位于脂筏内或脂筏外的蛋白质扩散时间的差异。可在对照条件或添加药物后动态进行采集。
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本文内容
摘要
摘要
在过去十五年中，细胞膜并非均质结构，而是依赖微区来发挥其功能的观点已得到广泛认可。脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，参与细胞的多种生理过程，如信号转导和物质运输1,2，同时也被认为在多种疾病中发挥关键作用，包括病毒感染、细菌感染以及神经退行性疾病3。
然而，它们的存在仍存在争议4,5。事实上，脂筏的大小估计约为20 nm6，远低于常规显微镜的分辨率极限（约200 nm），因此无法对其进行直接成像。迄今为止，用于评估目的蛋白在脂筏内分布的主要技术包括去垢剂抗性膜（DRMs）分离和抗体共贴片法。尽管这些技术因其操作相对简便而被广泛使用，但容易产生人为假象，因而受到批评7,8。因此，有必要进行技术改进，以克服这些假象，并能够在活细胞中探测脂筏的分布情况。
本文介绍一种用于灵敏分析活细胞质膜中荧光标记蛋白或脂质在脂筏中分布情况的方法。该方法称为荧光相关光谱法（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS），其原理基于位于脂筏内部或外部的荧光探针扩散时间的差异。事实上，在人工膜和细胞培养体系中均有证据表明，探针在致密脂筏外部的扩散速度显著快于其在脂筏内部的扩散9,10。为了测定扩散时间，可利用共聚焦显微镜在细胞质膜上的一个焦点体积（约1飞升）内，测量随时间变化的微小荧光波动（图1）。随后可根据这些波动绘制自相关曲线，并采用适当的数学扩散模型进行拟合11。
只要使用荧光标记，FCS 就可用于确定各种探针在脂筏中的分布情况。荧光标记可通过表达荧光融合蛋白或结合荧光配体来实现。此外，FCS 不仅可用于人工膜和细胞系，还可用于原代培养，正如近期研究所述12。它也可用于监测药物添加或膜脂质组成改变后脂筏分布动态的变化12。
方案
1. FCS 装置的校准
- 启动共聚焦显微镜、激光器、计算机以及用于温度和 CO2 控制的培养箱。
- 确保单光子雪崩二极管（SPAD）已开启，并且 SPAD 内部的荧光滤光片适用于您的样品。检查 SPAD 是否已实现时间同步。请注意，仅在 SPAD 设置已准备好进行数据采集时，才启动 FCS 软件。
- 配制新鲜的霍乱毒素-Alexa488 溶液，用 PBS 稀释至终浓度为 1 μg/ml（17.5 nM）。
- 使用显微镜的内部检测模式优化该溶液的共聚焦成像。
- 切换至点扫描模式，并在溶液样品中选择一个检测点。确保激光照射时间足够长，以完成 FCS 数据采集（> 5 分钟）。
- 切换至 SPAD 外部检测模式并进入 FCS 软件界面。监测荧光信号，确保其适合 SPAD 检测（信号充足但未饱和，10,000 至 50,000 计数/秒为宜）。如有必要，调整 z 轴位置、增益和/或激光功率，以获得合适的荧光信号。
- 采集 10 组、每组 30 秒的测量数据。采集时间应根据您的样品进行优化（在最佳采样效果与光漂白问题之间取得平衡）。
- 分析您的数据（参见步骤 4），确认获得的自相关曲线对应于溶液中单一荧光物质的扩散行为（拟合方程见图 2），且拟合得到的扩散时间正确（约 0.2 ms）（图 3）。
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讨论
本文介绍的FCS方法能够对活细胞中荧光探针在脂筏中的分布进行灵敏且快速的分析。FCS结合了共聚焦显微镜在定位上的精确性以及单光子计数的高灵敏度。FCS与标准生化技术的主要区别在于，FCS能够绝对定量目标分子在脂筏中的分布比例，而非像DRM分离或共聚集实验那样仅获得相对分布信息。
每个样品的FCS数据采集大约需要5分钟（10次采集，每次30秒），与常规生化技术相比速度相当快。这种快速性使得能够实时追踪药物添加后可能引起的脂筏分布变化。然而，自相关曲线的分析可能稍显复杂，因为需要逐一评估不同的拟合模型以确定最准确的一种。此外，采集过程中必须避免光漂白，否则可能产生伪影。
本文描述了一个示例，可用于界定脂质在脂筏中的分布情况：神经节苷脂 GM1（图 5）。此类研究若采用仅适用于蛋白质的标准生物化学方法则无法实现。荧光相关光谱（FCS）的应用不仅限于脂质，也可用于蛋白质研究，例如使用荧光配体标记的蛋白质（如 Alexa555 标记的转铁蛋白可结合定位于脂筏外的转铁蛋白受体9），或.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了法国国家研究署（ChoAD）资助项目的资助。我们还感谢ICM基金会（脑与脊髓研究所）提供的经济支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 霍乱毒素B亚基-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | 分子量（五聚体）= 57 kg/mol |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | SP5 | |
| 温度和CO2控制用培养箱 | Life imaging services | The Cube 和 The Box | |
| 单光子雪崩二极管（SPAD） | MPD（Micro Photon Devices） | PDM 系列（100 µm 灵敏区域） | |
| 488 nm 长通滤光片 | Semrock | 488 nm 截止边 BrightLine 长通滤光片，部件号 FF01-488/LP-25 | |
| FCS 检测单元 | Picoquant | Picoharp 300 模块 | |
| 数据采集与自相关软件 | Picoquant | SymPhoTime | |
| 拟合软件 | OriginLab | OriginPro8 |
参考文献
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons,....
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重印与许可
