本文描述了一种用于探测活细胞质膜上荧光蛋白在脂筏中分布情况的技术。该技术利用了位于脂筏内或脂筏外的蛋白质扩散时间的差异。可在对照条件或添加药物后动态进行采集。
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摘要
摘要
在过去十五年中，细胞膜并非均质结构，而是依赖微区来发挥其功能的观点已得到广泛认可。脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，参与细胞的多种生理过程，如信号转导和物质运输1,2，同时也被认为在多种疾病中发挥关键作用，包括病毒感染、细菌感染以及神经退行性疾病3。
然而，它们的存在仍存在争议4,5。事实上，脂筏的大小估计约为20 nm6，远低于常规显微镜的分辨率极限（约200 nm），因此无法对其进行直接成像。迄今为止，用于评估目的蛋白在脂筏内分布的主要技术包括去垢剂抗性膜（DRMs）分离和抗体共贴片法。尽管这些技术因其操作相对简便而被广泛使用，但容易产生人为假象，因而受到批评7,8。因此，有必要进行技术改进，以克服这些假象，并能够在活细胞中探测脂筏的分布情况。
本文介绍一种用于灵敏分析活细胞质膜中荧光标记蛋白或脂质在脂筏中分布情况的方法。该方法称为荧光相关光谱法（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS），其原理基于位于脂筏内部或外部的荧光探针扩散时间的差异。事实上，在人工膜和细胞培养体系中均有证据表明，探针在致密脂筏外部的扩散速度显著快于其在脂筏内部的扩散9,10。为了测定扩散时间，可利用共聚焦显微镜在细胞质膜上的一个焦点体积（约1飞升）内，测量随时间变化的微小荧光波动（图1）。随后可根据这些波动绘制自相关曲线，并采用适当的数学扩散模型进行拟合11。
只要使用荧光标记，FCS 就可用于确定各种探针在脂筏中的分布情况。荧光标记可通过表达荧光融合蛋白或结合荧光配体来实现。此外，FCS 不仅可用于人工膜和细胞系，还可用于原代培养，正如近期研究所述12。它也可用于监测药物添加或膜脂质组成改变后脂筏分布动态的变化12。
方案
1. FCS 装置的校准
- 启动共聚焦显微镜、激光器、计算机以及用于温度和 CO2 控制的培养箱。
- 确保单光子雪崩二极管（SPAD）已开启，并且 SPAD 内部的荧光滤光片适用于您的样品。检查 SPAD 是否已实现时间同步。请注意，仅在 SPAD 设置已准备好进行数据采集时，才启动 FCS 软件。
- 配制新鲜的霍乱毒素-Alexa488 溶液，用 PBS 稀释至终浓度为 1 μg/ml（17.5 nM）。
- 使用显微镜的内部检测模式优化该溶液的共聚焦成像。
- 切换至点扫描模式，并在溶液样品中选择一个检测点。确保激光照射时间足够长，以完成 FCS 数据采集（> 5 分钟）。
- 切换至 SPAD 外部检测模式并进入 FCS 软件界面。监测荧光信号，确保其适合 SPAD 检测（信号充足但未饱和，10,000 至 50,000 计数/秒为宜）。如有必要，调整 z 轴位置、增益和/或激光功率，以获得合适的荧光信号。
- 采集 10 组、每组 30 秒的测量数据。采集时间应根据您的样品进行优化（在最佳采样效果与光漂白问题之间取得平衡）。
- 分析您的数据（参见步骤 4），确认获得的自相关曲线对应于溶液中单一荧光物质的扩散行为（拟合方程见图 2），且拟合得到的扩散时间正确（约 0.2 ms）（图 3）。
2. 使用脂筏标记物对活细胞进行染色
- 成像前一天将 HEK293 细胞接种于经多聚-L-赖氨酸（1 mg/ml）包被的 8 孔 Labtek 培养板中，以确保细胞贴壁良好。使用不含酚红的培养基，避免对荧光信号造成干扰。
- 用 HBSS（Hank's 平衡盐溶液）洗涤细胞两次。
- 在 37 °C 条件下，向细胞中加入含霍乱毒素-Alexa488（1 μg/ml）和 BSA（0.1%）的 500 μl HBSS，孵育 30 分钟。霍乱毒素可结合神经节苷脂 GM1，而 GM1 已知优先分布于脂筏中。
- 用 HBSS（Hank's 平衡盐溶液）洗涤细胞两次。
3. 活细胞的FCS数据采集
- 将染色后的细胞置于显微镜载物台上。确保温度和 CO2 条件处于最佳状态，否则可能导致扩散时间出现伪影。
- 使用显微镜的内部检测模式优化目标细胞的共聚焦成像（图 4）。
- 切换至点扫描模式，并在目标细胞的质膜上选择一个点。进行 1-2 次活细胞成像，以确保采集过程中细胞未发生移动。
- 切换至 SPAD 外部检测并进入 FCS 软件界面。监测荧光信号，确保其适合 SPAD 检测（信号充足但无饱和，10 000 至 50 000 计数/秒为宜）。如有必要，调整 z 轴位置、增益和/或激光功率以获得合适的荧光信号。若仍不理想，可考虑调整染色条件。
- 采集 10 次、每次 30 秒的测量样本。由于大多数细胞具有自发荧光，前几次采集过程中可能会观察到荧光信号因自发荧光衰减而降低。
4. FCS 数据分析
- 设置相关时间间隔，并使用 FCS 软件生成自相关曲线。相关时间间隔通常从可分辨的最短延迟时间开始，到最长可能时间结束（由于当最大相关时间接近总采集时间时，测量的统计性会越来越不足，因此 Picoquant 软件将最大延迟时间限制为采集时间的 80%）。
- 针对每个样品，导出对应于荧光波动以及随时间变化的自相关函数的数据文件。
- 使用 Origin Pro 等数据分析与拟合软件导入这些文件。
- 针对每个样品，确认采集过程中无光漂白现象，即荧光在 30 秒内保持稳定。若测量结果显示存在光漂白，应予以剔除，因为这可能导致人为延长的扩散时间。
- 检查剩余 FCS 曲线的形状是否正确（见图 5），并确定平均 FCS 曲线。
- 使用适当的数学模型对曲线进行拟合（图 2）。该拟合将提供扩散时间及以该（些）扩散时间扩散的分子比例。
5. 代表性结果
使用霍乱毒素-Alexa488溶液进行FCS校准的示例如下所示 图3. 在确认荧光强度随时间变化的单个测量结果未显示任何光漂白现象后（图3A），计算单个及平均FCS曲线，并使用对应于不同扩散模型的方程对平均FCS曲线进行拟合（示例见 图2）。传统上用于确定拟合优度的参数是决定系数 R2. R 越接近2 为1时，拟合度越高。在此情况下，用于拟合平均FCS曲线最精确的模型是描述一群荧光分子在三维空间中自由扩散的模型（图2和图3B中的公式1）。拟合得到的扩散时间为 0.32 ms。曲线拟合的残差（图3C）和 R2 因子（0.99906）给出了拟合质量的估计值。
霍乱毒素-Alexa488 染色的 HEK293 细胞的 FCS 分析示例显示在 图5多相平均FCS曲线形状揭示了具有不同扩散时间的荧光分子群体的存在。对该曲线的最佳拟合对应于包含三个荧光探针群体的模型：其中两个群体表现为受阻扩散（在二维中扩散，如在膜平面内），另一个群体则在三维空间中自由扩散。图2和图5中的公式2）。后者对应于在膜平面外运动的荧光分子，即与膜靶点结合或解离、通过分泌或再循环途径到达膜，或通过内吞作用离开膜。在膜上检测到两种与霍乱毒素结合 GM1 相关的扩散时间：2 ms（占分子总数的 25%），对应于脂筏外的扩散；75 ms（占分子总数的 50%），对应于脂筏内的扩散。请注意，采集过程中任何光漂白都会导致人为延长的扩散时间，从而可能造成 GM1 定位于脂筏结构域的假象。
图1. FCS装置的示意图（图片改编自 Marquer et al.12）
图2. 扩散模型示例及用于拟合自相关曲线的相应方程。结构参数 S 可表示为 S = z0/w0 与 z0 光轴方向上1/e处的有效焦半径2 强度和 w0 为 1/e 处的有效横向焦半径2 强度。这些值可从经典的点扩散函数（PSF）测量中提取。
图 3. 霍乱毒素-Alexa488 在溶液中扩散时间的评估，用于 FCS 校准。A) 一次代表性 30 秒采集的荧光波动随时间变化曲线。B) 由 10 次 30 秒采集样本得到的平均自相关曲线，采用公式 1（见图 2）进行拟合。C) 曲线拟合的残差。
图 4. 用霍乱毒素-Alexa488 染色的 HEK-293 细胞。使用 SP5 共聚焦显微镜（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）并配合内置 488 nm 激光线进行成像。荧光信号通过 x60 平场复消色差油浸物镜在 500 至 650 nm 波长范围内采集。
图 5. 霍乱毒素-Alexa488 在 HEK293 细胞质膜上扩散时间的评估。A) 使用公式 2 拟合的平均自相关曲线（见图 2）。B) 曲线拟合的残差。（改编自 Marquer et al.12）
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讨论
本文介绍的FCS方法能够对活细胞中荧光探针在脂筏中的分布进行灵敏且快速的分析。FCS结合了共聚焦显微镜在定位上的精确性以及单光子计数的高灵敏度。FCS与标准生化技术的主要区别在于，FCS能够绝对定量目标分子在脂筏中的分布比例，而非像DRM分离或共聚集实验那样仅获得相对分布信息。
每个样品的FCS数据采集大约需要5分钟（10次采集，每次30秒），与常规生化技术相比速度相当快。这种快速性使得能够实时追踪药物添加后可能引起的脂筏分布变化。然而，自相关曲线的分析可能稍显复杂，因为需要逐一评估不同的拟合模型以确定最准确的一种。此外，采集过程中必须避免光漂白，否则可能产生伪影。
本文描述了一个示例，可用于界定脂质在脂筏中的分布情况：神经节苷脂 GM1（图 5）。此类研究若采用仅适用于蛋白质的标准生物化学方法则无法实现。荧光相关光谱（FCS）的应用不仅限于脂质，也可用于蛋白质研究，例如使用荧光配体标记的蛋白质（如 Alexa555 标记的转铁蛋白可结合定位于脂筏外的转铁蛋白受体9），或...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了法国国家研究署（ChoAD）资助项目的资助。我们还感谢ICM基金会（脑与脊髓研究所）提供的经济支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 霍乱毒素B亚基-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | 分子量（五聚体）= 57 kg/mol |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | SP5 | |
| 温度和CO2控制用培养箱 | Life imaging services | The Cube 和 The Box | |
| 单光子雪崩二极管（SPAD） | MPD（Micro Photon Devices） | PDM 系列（100 µm 灵敏区域） | |
| 488 nm 长通滤光片 | Semrock | 488 nm 截止边 BrightLine 长通滤光片，部件号 FF01-488/LP-25 | |
| FCS 检测单元 | Picoquant | Picoharp 300 模块 | |
| 数据采集与自相关软件 | Picoquant | SymPhoTime | |
| 拟合软件 | OriginLab | OriginPro8 |
参考文献
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