慢性尼古丁给药条件下，荧光标记的烟碱型受体在基因敲入小鼠中的共聚焦光谱成像

摘要

我们开发了一种新技术，通过结合基因敲入方法对受体进行荧光蛋白标记以及光谱共聚焦成像等多种手段，定量分析中枢神经系统特定亚型神经元亚细胞区域中烟碱型乙酰胆碱受体的变化，以更深入地理解尼古丁成瘾的机制。

摘要

中枢神经系统（CNS）中的配体门控离子通道与多种具有严重医学和社会后果的疾病相关。例如，通过吸烟导致的尼古丁成瘾是全球早逝的主要原因之一（世界卫生组织），其可能机制是大脑中离子通道分布的改变¹。在啮齿类动物和人类中，长期暴露于尼古丁会导致脑组织中烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）数量增加^1-3。 similarly，谷氨酸能受体 GluN1 或 GluA1 通道的改变也与对其他成瘾性药物（如可卡因、苯丙胺和阿片类药物）的敏感化有关^4-6。

因此，绘制并量化特定离子通道的分布和表达模式的能力对于理解成瘾机制至关重要。针对不同脑区药物作用的研究随着放射性配体等技术的出现而得到推进。然而，放射性配体结合技术的空间分辨率较低，无法对特定神经元亚型中的配体门控离子通道进行定量分析。

基因编码的荧光报告分子，例如绿色荧光蛋白（GFP）及其多种颜色变体，已彻底改变了生物学领域⁷。通过将荧光报告分子与内源性蛋白质进行基因融合，可在活体（in vivo）中对蛋白质进行可视化观察^7–10。使用荧光探针标记蛋白质的一个优势在于避免了抗体的使用，而抗体常存在非特异性结合以及难以接近靶蛋白的问题。我们已采用该策略对烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）进行荧光标记，从而可在转染的培养细胞中利用 Förster 共振能量转移（FRET）研究受体的组装过程¹¹。最近，我们进一步采用基因敲入（knock-in）策略构建了表达黄色荧光蛋白标记的 α4 nAChR 亚基（α4YFP）的小鼠模型，使得可通过光谱共聚焦显微镜在中枢神经系统（CNS）神经元中以亚微米分辨率对受体进行离体（ex vivo）精确定量¹²。该靶向性荧光基因敲入突变被整合至内源基因位点，并由其天然启动子调控，与野生型小鼠中未标记的受体相比，其表达水平和调控特性均保持正常。这一基因敲入策略可进一步拓展应用于其他离子通道的荧光标记，为在中枢神经系统中可视化和定量受体提供了强有力的手段。

本文描述了一种在长期尼古丁暴露后定量特定中枢神经系统神经元中 nAChR 表达变化的方法。我们的方法包括微型渗透泵植入、心脏灌注固定、来自 α4YFP 基因敲入小鼠的荧光标记烟碱受体亚基的成像与分析（图 1）。我们优化了固定技术，以尽量减少固定脑组织中的自发荧光。我们详细介绍了使用光谱共聚焦显微镜结合线性光谱解混算法进行成像的方法，以扣除自发荧光信号，从而准确获取 α4YFP 荧光信号。最后，我们展示了长期尼古丁暴露引起海马内侧穿通路中 α4YFP 受体上调的结果。

方案

1. 泵植入

1. 在植入泵之前，填充并准备 Alzet 微渗透泵（Alzet，型号 2002，Cupertino，USA），注意避免引入气泡。该型号微渗透泵以 0.5 μl/hr 的速率持续输送溶液 14 天。确保无菌条件。称量空泵和填充后的泵。在实验结束时（植入后 10 天），可用注射器和针头从泵中抽出剩余液体并称重，以计算已泵出的体积。
2. 含对照溶液的泵中装有生理盐水（0.9% w/v，Teknova，S5819，Hollister，USA）。配制尼古丁溶液时，将 1 M 储存液的 (-)-尼古丁酒石酸氢盐（Sigma，货号# N5260）用生理盐水（0.9% w/v）稀释，并通过 0.22 μm 注射器滤器过滤除菌。我们此前曾以 0.4 和 2 mg/kg/hr（按尼古丁游离碱计算）的剂量连续给予尼古丁 10 天。
3. 准备三个盐水浴（三个盛有盐水的 10 cm 培养皿）。泵填充并封口后，依次在每个盐水浴中彻底清洗泵体，以去除外壳表面残留的药物。将填充好的泵浸入盐水溶液中保存直至手术，对照泵与尼古丁泵应分别置于不同的盐水容器中。
4. 为促进动物术后健康恢复并降低术后感染风险，应提前准备好清洁的笼具用于长期恢复。
5. 手术后即刻的短期恢复阶段，准备一个配备加热垫和加热灯的笼具。
6. 为研究慢性尼古丁作用，每组使用 5 至 6 只纯合 α4YFP 基因敲入小鼠（2–3 月龄）（对照组或尼古丁组）。α4YFP 基因敲入小鼠品系已回....

讨论

在基因敲入小鼠模型中使用荧光受体来确定特定离子通道的数量和定位具有多项优势。与在所有细胞中普遍表达的蛋白质（如肌动蛋白）不同，离子通道的数量要少得多，且其在不同神经元亚型中的表达存在差异，这使得通过传统的免疫组织化学技术进行准确分析具有挑战性。α4YFP基因产物在野生型（WT）水平表达，受相同的启动子、增强子和转运机制调控¹²。荧光受体也表现出与野生型离子通道相同的功能和敏感性¹²。遗憾的是，传统免疫组织化学方法在对固定的小鼠神经组织切片使用多种常见抗体时，常出现抗体渗透不完全的问题¹⁷，从而导致结果偏差。而基因敲入模型可在整个组织中提供一致的荧光强度（图6）。尽管某些商业抗体可能存在非特异性结合的问题^{18, 19}，但通过谨慎选择抗体种类与浓度，并设置适当的对照，仍可实现中枢神经系统中烟碱型受体的免疫组织化学定位^{20, 21}。α4YFP荧光的变化反映了受体亚基蛋白表达的改变，可在亚细胞分辨率下对特定神经元亚型进行定量分析。这些结果可结合Western blot技术用于量化蛋白表达水平，以及RT-PCR技术用于检测mRNA转录水.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型渗透泵	Alzet	型号 2002
生理盐水	TEKnova, Inc.	S5819
(-)-烟碱酒石酸氢盐	Sigma-Aldrich	N5260
眼药水	诺华公司	Tear-Gel
Vetbond 黏合剂	3M	1469SB
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
氯胺酮	惠氏动物健康	0856-4403-01
盐酸美托咪啶	辉瑞制药有限公司	1950673
23G 蝴蝶针	BD 生物科学	367253
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15710
塑料包埋模具	VWR 国际公司	18986-1
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD Millipore	475904	pH 8.5