黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

摘要

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。

摘要

微移液管黏附实验于1998年开发，用于测量二维（2D）受体-配体结合动力学¹。该实验采用人红细胞（RBC）作为黏附传感器，并作为其中一种相互作用分子的呈递细胞。通过显微操作技术，将红细胞与表达另一种相互作用分子的细胞进行接触，精确控制接触面积和接触时间，以促进分子间结合的形成。当将两个细胞拉开时，红细胞的伸长现象即指示了黏附事件的发生。通过调控固定在红细胞表面配体的密度，使黏附概率保持在0到1之间的中等范围。对于给定的接触时间，通过重复多次细胞接触循环，根据黏附事件发生的频率来估算黏附概率。改变接触时间可获得一条结合曲线。将受体-配体反应动力学的概率模型¹拟合至该结合曲线，即可获得二维亲和力和解离速率。

该检测方法已通过以下相互作用得到验证：Fcγ受体与IgG Fc^1-6、选择素与糖缀合物配体^6-9、整合素与配体^10-13、同嗜性钙黏蛋白结合¹⁴，以及T细胞受体及其共受体与肽-主要组织相容性复合物^15-19的相互作用。

该方法已被用于量化生物物理因素对二维动力学的调控作用，例如膜微拓扑结构⁵、膜锚定方式²、分子取向和长度⁶、载体刚度⁹、曲率²⁰以及碰撞力²⁰，以及生化因素，例如细胞骨架和相互作用分子所处的膜微环境的调节因子，以及这些分子的表面组织方式^15,17,19。

该方法还被用于研究双受体-配体物种的同步结合^3,4，以及利用改进模型研究三分子相互作用¹⁹²¹。

该方法的主要优势在于能够在其天然膜环境中研究受体，所得结果可能与使用纯化受体获得的结果大不相同¹⁷。此外，该方法还能够在亚秒级时间尺度上研究受体-配体相互作用，其时间分辨率远超典型的生化方法。

为了说明微管黏附频率法，我们展示了红细胞上功能化的细胞间黏附分子1（ICAM-1）与中性粒细胞上的整合素α_Lβ₂结合的动力学测量结果，实验溶液中加入二聚体E-选择素以激活α_Lβ₂。

方案

1. 从全血中分离红细胞

1. 配制 EAS-45 溶液。称取 表 I 中列出的所有成分，溶于 100–200 ml 去离子水中。加水定容至 1000 ml，并调节 pH 至 8.0。过滤后分装为每份 50 ml，于 -20°C 冷冻保存。

注意：步骤 1.2 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行。

2. 从肘正中静脉抽取3-5ml血液至含有EDTA的10ml试管中，并立即轻柔充分混匀，使血液与EDTA充分混合，以防凝血。
3. 尽快处理血样。除离心步骤外，以下所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持无菌状态。将血液转移至50ml离心管中，加入10ml冷且无菌的Histopaque 1077，于4°C、1000rpm离心5分钟。重复此步骤两次。
4. 加入10ml冷且无菌的PBS，于4°C、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。重复该洗涤步骤4次（共5次）。
5. 用无菌EAS-45洗涤两次（每次5分钟，4°C，1000rpm）。最后一次洗涤时，将红细胞转移至新的无菌15ml离心管中。
6. 将红细胞重悬于10ml EAS-45中。

2. 红细胞生物素标记

1. 取步骤1中装有红细胞（RBCs）的....

讨论

为了成功使用微管黏附频率测定法，应考虑几个关键步骤。首先，务必记录所关注的受体-配体系统之间的特异性相互作用。非特异性对照测量（参见图3、图4）可确保特异性。理想情况下，所有接触时间下的非特异性黏附概率应低于0.05，并且在每个时间点上，特异性与非特异性黏附概率之间应存在显著差异。可采用不同的方法将配体偶联到红细胞表面。已有研究表明，与生物素-链霉亲和素偶联法相比，氯化铬偶联法¹⁷会导致更高的非特异性结合水平。

其次，特异性相互作用的黏附概率应处于中等范围。这一要求可通过调整受体和配体的密度来满足（如果细胞上的受体为组成型表达且其密度难以改变，则可仅调整红细胞上的配体密度）。为此，在测试受体-配体结合亲和力未知的新系统时，应制备一系列不同生物素化程度的红细胞（参见表III作为示例），以测试多种配体密度。稳态下的平均黏附概率不应超过0.8，因为细胞间受体密度的差异通常会导致部分细胞的黏附水平达到1，尤其是在平均配体密度过高的情况下。在初步特异性测试过程中，若发现部分细胞的黏附水平为0或1，则需调整配体密度。非特异性对照实验通常在特异性实验之后进行，此时希望黏附概.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	使用前用去离子水稀释至1倍浓度
Vacutainer EDTA	BD 生物科学	366643	红细胞分离
10毫升 PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	红细胞分离
腺嘌呤	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 制备
D-葡萄糖（右旋糖）	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 制备
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 制备
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 制备
磷酸氢二钠（Na₂HPO₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 制备
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 制备
Biotin-X-NHS	Calbiochem	203188	红细胞生物素标记
二甲基甲酰胺（DMF）	赛默飞世尔科技公司	20673	红细胞生物素标记
硼酸盐缓冲液（0.1 M）	电子显微镜科学公司	11455-90	红细胞生物素标记
链霉亲和素	赛默飞世尔科技公司	21125	配体功能化
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	配体功能化
Quantibrite PE 珠	BD 生物科学	340495	密度定量
流式细胞仪	BD 生物科学	BD LSR II	密度定量
毛细管 0.7-1.0 mm × 30"	Kimble Chase	46485-1	微移液管拉制
矿物油	Fisher Scientific	BP2629-1	腔室组装
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-544-G	腔室组装
PE α人 CD11a 克隆 HI 111	eBioscience	12-0119-71	图1所用试剂
PE 抗人 CD54	eBioscience	12-0549	图1试剂
小鼠 IgG1 同型对照 PE	eBioscience	12-4714	图1所用试剂
液压显微操作器	Narishige International	MO-303	微量移液系统
机械操作臂	Newport Corp.	461-xyz-m, SM-13, DM-13	微量移液系统
压电–电动翻译器	Physik Instruments	P-840	微量移液系统
LabVIEW	国家仪器公司	版本 8.6	微量移液系统
数据采集板	国家仪器公司	USB-6008	微量移液系统
光学平台	动力学系统	5200 系列	微量移液系统