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黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

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DOI：

10.3791/3519

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2011年11月2日

 , 
1Biomedical Engineering Department, Georgia Institute of Technology

本文内容

摘要

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。

摘要

微移液管黏附实验于1998年开发，用于测量二维（2D）受体-配体结合动力学1。该实验采用人红细胞（RBC）作为黏附传感器，并作为其中一种相互作用分子的呈递细胞。通过显微操作技术，将红细胞与表达另一种相互作用分子的细胞进行接触，精确控制接触面积和接触时间，以促进分子间结合的形成。当将两个细胞拉开时，红细胞的伸长现象即指示了黏附事件的发生。通过调控固定在红细胞表面配体的密度，使黏附概率保持在0到1之间的中等范围。对于给定的接触时间，通过重复多次细胞接触循环，根据黏附事件发生的频率来估算黏附概率。改变接触时间可获得一条结合曲线。将受体-配体反应动力学的概率模型1拟合至该结合曲线，即可获得二维亲和力和解离速率。

该检测方法已通过以下相互作用得到验证：Fcγ受体与IgG Fc1-6、选择素与糖缀合物配体6-9、整合素与配体10-13、同嗜性钙黏蛋白结合14，以及T细胞受体及其共受体与肽-主要组织相容性复合物15-19的相互作用。

该方法已被用于量化生物物理因素对二维动力学的调控作用，例如膜微拓扑结构5、膜锚定方式2、分子取向和长度6、载体刚度9、曲率20以及碰撞力20，以及生化因素，例如细胞骨架和相互作用分子所处的膜微环境的调节因子，以及这些分子的表面组织方式15,17,19。

该方法还被用于研究双受体-配体物种的同步结合3,4，以及利用改进模型研究三分子相互作用1921。

该方法的主要优势在于能够在其天然膜环境中研究受体，所得结果可能与使用纯化受体获得的结果大不相同17。此外，该方法还能够在亚秒级时间尺度上研究受体-配体相互作用，其时间分辨率远超典型的生化方法。

为了说明微管黏附频率法，我们展示了红细胞上功能化的细胞间黏附分子1（ICAM-1）与中性粒细胞上的整合素αLβ2结合的动力学测量结果，实验溶液中加入二聚体E-选择素以激活αLβ2。

方案

1. 从全血中分离红细胞

  1. 配制 EAS-45 溶液。称取表 I中列出的所有成分，溶于 100–200 ml 去离子水中。加水定容至 1000 ml，并调节 pH 至 8.0。过滤后分装为每份 50 ml，于 -20°C 冷冻保存。

注意：步骤 1.2 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）根据机构审查委员会批准的方案进行操作。

  1. 从肘正中静脉抽取3-5ml血液至含有EDTA的10ml试管中，并立即轻柔充分混匀，使血液与EDTA充分混合，以防凝血。
  2. 尽快处理血样。除离心步骤外，以下所有操作均应在生物安全柜中进行，以保持无菌状态。将血液转移至50ml离心管中，加入10ml冷且无菌的Histopaque 1077，于4°C、1000rpm离心5分钟。重复此步骤两次。
  3. 加入10ml冷且无菌的PBS，于4°C、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。重复该步骤4次（共5次）。
  4. 用无菌EAS-45洗涤两次（每次4°C、1000rpm离心5分钟）。最后一次洗涤时，将红细胞转移至新的无菌15ml离心管中。
  5. 将红细胞重悬于10ml EAS-45中。

2. 红细胞生物素标记

  1. 从第1步中取出含有红细胞的离心管，以1000 rpm离心5分钟，4℃条件下去除所有上清液°C. 加入10μ将红细胞沉淀按每管 l 分装至若干小管中，每管加入相应体积的 PBS（参见 表 II 例如制备六种不同浓度的RBCs生物素化样本。
  2. 根据需要配制新鲜的Biotin-X-NHS/DMF 1:10、1:100稀释液 表 II.
  3. 加入10μ向每个小瓶中加入0.1 M硼酸盐缓冲液。
  4. 加入计算量的生物素溶液至每个小瓶（参见 表 II 例如）并立即涡旋振荡。
  5. 将每个红细胞小瓶放入50 ml锥形管中，在室温下置于旋转仪上孵育30分钟。
  6. 每个小瓶用800 μL洗涤液洗涤3次μ2 mL EAS-45，2000 rpm 离心 2 分钟。
  7. 加入100μ将 45 微升 EAS-45 加入每个小瓶中，并在 4 ℃ 下保存°C. 每个1μ最终溶液的体积现在应为 ˜1×10⁶ 个红细胞

3. 在红细胞上对生物素连接的配体进行功能化*

  1. 根据制造商说明书配制 2mg/ml 的链霉亲和素溶液。分装后的溶液可在 -20°C 保存。
  2. 取第 2.7 步的红细胞（10μl）与等量链霉亲和素溶液混合，立即涡旋，并在 4°C 下旋转孵育 30 分钟。
  3. 用 500μl EAS-45 洗涤 3 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。
  4. 取第 3.3 步的红细胞（10μl）与等量 20μg/ml 配体溶液混合，立即涡旋，并在室温下旋转孵育 30 分钟。
  5. 用 500μl EAS-45/1% BSA 洗涤 2 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。

*如果您的蛋白质没有生物素连接，可以使用市售的蛋白质生物素化试剂盒（例如，Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit），或如视频中所示，使用生物素化的捕获抗体作为中间步骤。

4. 受体和配体密度的定量分析

  1. 将第3步中配体包被的红细胞与另一小瓶中含有受体的细胞分别在室温下与各自相应的单克隆抗体（mAb）饱和浓度共同孵育30分钟。对照组则分别在不同小瓶中与无关的同型匹配抗体孵育。如果一抗未标记荧光，根据制造商说明书与荧光标记的二抗共同孵育。
  2. 使用相应的荧光校准微球，通过流式细胞术分析第4.1步制备的样品。按图1所示计算密度。

5. 微量移液器和细胞培养腔的准备

  1. 使用 PN-30 Narishige 磁性玻璃微电极水平拉制仪或 Sutter 仪器微移液管拉制仪，从毛细管中拉制微移液管。
  2. 使用带微熔接装置的显微操作器，调节拉制后的微移液管尖端至所需尺寸（通常所需直径范围为 1–5 μm，具体取决于实验所用细胞的大小）。
  3. 通过将显微镜盖玻片切割至所需尺寸来制备细胞腔室。从两侧用矿物油密封腔室，以防止培养基蒸发导致实验过程中渗透压改变。
  4. 将携带受体和配体的细胞加入腔室中。

6. 微管粘附频率测定

  1. 用相应的移液器吸取相互作用的细胞，并使用计算机编程的压电驱动器控制红细胞与另一细胞接触和分离的过程，调节接触面积和接触时间。通过观察细胞分离时红细胞的拉伸现象来检测黏附事件。
  2. 对给定的接触时间重复接触-回缩循环50–100次。在Excel电子表格的一列中记录观察到的黏附事件：发生黏附记为“1”，无黏附记为“0”。可使用录像设备（如数字媒体或录像带）记录显微图像。
  3. 对每个接触时间点，至少使用三组不同的细胞对，记录黏附频率随接触时间变化的曲线，以获得均值和标准误（SEM）。
  4. 通过使用包被无关配体（如BSA）的红细胞和/或使用特异性功能阻断型单克隆抗体封闭配体或受体，记录对照组的非特异性结合曲线。每个接触时间点的特异性黏附频率可通过从总黏附频率中减去非特异性黏附频率得到1。

7. 数据分析

  1. 利用一个概率模型（公式1）拟合特异性黏附频率 Pa 随接触时间 t 变化的实验数据，该模型描述了单一类型受体与单一类型配体之间发生的二级正向反应和一级逆向反应的单步相互作用1：
    figure-protocol-1
    其中 Ka 为二维有效结合亲和力，koff 为解离速率，mr 和 ml 分别为第4步中测得的受体和配体密度，Ac 为接触面积。该曲线拟合包含两个参数：AcKa 和 koff，其中 Ac 与 Ka 被合并为一个参数，统称为有效二维亲和力。其与解离速率的乘积即为有效二维结合速率：Ackon = AcKa × koff。
    特异性黏附频率 Pa 通过从总测得黏附频率（Pmeasured）中减去非特异性黏附组分（Pnonspecific）计算得到1,21：
    figure-protocol-2

8. 典型结果：

figure-protocol-3
图 1 中性粒细胞上整合素 αLβ2 位点密度的测定。中性粒细胞首先在 1 μg/ml 的 E-选择素-Ig 中孵育 10 分钟，以匹配图 3 和图 4 中使用的实验条件，或不加 E-选择素-Ig 作为对照；随后在饱和浓度（10 μg/ml）下与 PE 标记的抗人 CD11a 单克隆抗体（克隆号 HI111，参见试剂与设备列表）或作为对照的无关小鼠 IgG1 孵育，洗涤后立即进行分析。样品使用 BD LSR 流式细胞仪检测，并配合标准 QuantiBRITE PE 校准微球。图 A 显示了校准微球的荧光直方图（粉红色），以及经 E-选择素-Ig 处理（蓝色）或未处理细胞（绿色）的直方图。特异性 CD11a 单抗染色以实线表示，同型匹配的无关对照抗体染色以虚线表示。在整个洗涤步骤及 FACS 缓冲液中均含有 E-选择素-Ig 的细胞，其 CD11a 密度与未处理细胞相比无变化。图 B 显示了密度定量的过程。计算图 A 中四个校准微球直方图各峰的平均荧光强度（FI）的 Log10 值（粉红色圆圈），以及每种微球对应的每微球 PE 分子数（来自生产商）的 Log10 值。以每微球 PE 分子数的 Log10 值为横坐标，荧光强度的 Log10 值为纵坐标，绘制线性回归曲线。对于经 E-选择素处理的细胞，特异性单抗的 Log10 FI（y）值为 3.99（蓝色实心圆），对照抗体为 2.23（蓝色空心圆）。通过该线性方程求解 x 值（在图 B 中以绿色和蓝色圆圈标出）。x = Log10 PE/细胞，由于 PE 与单抗的比例为 1:1，因此中性粒细胞表面 αLβ2 的总数计算为 9587。利用中性粒细胞直径 8.4 μm22，计算得表面密度为 43 个分子/μm2。ICAM-1 的密度采用 PE 标记的抗人 CD54 单抗通过流式细胞术类似测定，结果为 65 分子/μm2。

figure-protocol-4
图2 微移液系统示意图。我们的微移液系统为自行组装，包含三个子系统：成像子系统，用于观察、记录和分析微移液管吸取细胞的运动；显微操作子系统，用于从细胞室中选择细胞；以及压力子系统，用于将细胞吸入微移液管中。成像子系统的中心部件是一台倒置显微镜（Olympus IMT-2 IMT2），配备100倍油浸1.25 N.A.物镜。图像通过电荷耦合器件（CCD）相机传输至录像机。系统连接有视频计时器，用于记录时间。每个微移液管可通过安装在显微镜上的机械驱动装置进行操作，并通过三轴液压显微操纵器进行精细定位。也可使用Newport公司的机械操纵器。其中一个微移液管支架安装在压电平移台上，其驱动器由计算机LabView程序（可应要求提供）控制，信号经由电压放大器（自制）通过DAQ板传输至压电执行器。这使得在黏附测试循环中能够精确且可重复地移动移液管。压力调节子系统用于在实验过程中控制负压。液压管路将微移液管支架连接至液体储液器。通过精细机械定位器可精确调节储液器的高度。

使用 KIMAX 熔点测定用硼硅酸盐玻璃毛细管（外径为 1.0±0.07 mm，内径为 0.7±0.07 mm）制备显微注射针。首先，采用 PN-30 Narishige 磁性玻璃微电极水平拉制仪（Sutter Instruments 显微注射针拉制仪为另一种可选设备）将毛细管拉制成显微注射针。其次，使用自制的显微加工系统（Microforge system）将显微注射针切割至所需的开口大小。市面上也有商用的显微加工系统可供选择。

为避免实验过程中微量移液器产生振动，将显微镜连同显微操作器一起放置在空气悬浮台上。

figure-protocol-5
图3 特异性（A）和非特异性（B）结合在1秒（红色）和10秒（蓝色）接触时间下，通过ICAM-1（A）或hIgG（B）包被的红细胞与表达整合素αLβ2的人中性粒细胞之间重复黏附测试循环测得的黏附频率Fi。Fi = (X1 + X2 +…+ Xi)/i（1 ≤i ≤ n），其中i为测试循环序号，Xi取值为“1”（发生黏附）或“0”（无黏附）。采用Fn（n=50）作为黏附概率的最佳估计值。

figure-protocol-6
图4 ICAM-1 与中性粒细胞整合素结合动力学 αLβ2 (figure-protocol-7。如图3所示，对每个接触时间下的三对细胞测得的黏附概率取平均值，并绘制为接触时间的函数。腔室中的培养基为含1 mM Ca的HBSS2+ 和 Mg2+ 加 1μ二聚体 E-selectin-Ig 以 g/ml 浓度上调 αLβ2 结合。为了在红细胞上捕获 ICAM-1-Ig，增加了一个中间步骤，即将红细胞与 10μg/ml 捕获抗体（生物素化山羊抗人 Fc 抗体，eBioscience），在链霉亲和素孵育步骤之后。为控制非特异性结合，采用两种不同条件：1）用抗人 Fc 捕获抗体包被的红细胞，与人 IgG 而非 ICAM-1-Ig（O）孵育；2）中性粒细胞与未包被捕获抗体的红细胞结合Δ). 10μg/ml 人 IgG 被加入培养基中，以最大限度减少溶液中 E-选择素-Ig 与红细胞表面捕获抗体的非特异性结合。以人 IgG 作为对照曲线记录的非特异性结合用于获得特异性黏附概率曲线。figure-protocol-8) 使用公式 2 计算。使用公式 1（实线）拟合特异性黏附概率曲线得到有效结合亲和力 AcKa = 1.4•10-4 μm4 和 k关闭 = 0.3 s-1.

试剂 分子量 (g/mol) 浓度 (mM) 用量 (g)
腺嘌呤135.1320.27
D-葡萄糖（右旋糖）180.1611019.82
D-甘露醇182.175510.02
氯化钠 (NaCl)58.44502.92
磷酸氢二钠 (Na HPO )141.95202.84
L-谷氨酰胺146.15101.46

表1. EAS-45 缓冲液配制（1L）。

550 μl DMF 中的 25 mg 生物素-XHS0.1M 生物素溶液
用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 10 倍0.01M 生物素溶液
用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 100 倍0.001M 生物素溶液

表2. 生物素溶液的配制。

生物素终浓度 (μM) 4 10 20 50 100 160
RBCs沉淀储备液 (μl)101010101010
1x PBS (μl)179.2178176179178176.8
0.1M 硼酸缓冲液 (μl)101010101010
0.01M 生物素溶液 (μl)   123.2
0.001M 生物素溶液 (μl)0.824   

表3. 红细胞的生物素标记。

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讨论

为了成功使用微管黏附频率测定法，应考虑几个关键步骤。首先，务必记录所关注的受体-配体系统的特异性相互作用。非特异性对照测量（参见图3、图4）可确保特异性。理想情况下，所有接触时间下的非特异性黏附概率应低于0.05，并且在每个时间点上，特异性与非特异性黏附概率之间应存在显著差异。可采用不同方法将配体偶联至红细胞表面。已有研究表明，与生物素-链霉亲和素偶联法相比，氯化铬偶联方法17会导致更高的非特异性结合水平。

其次，特异性相互作用的黏附概率应处于中等范围。这一要求可通过调整受体和配体的密度来满足（如果细胞上的受体为组成型表达且其密度难以改变，则可仅调整红细胞上的配体密度）。为此，在测试受体-配体结合亲和力未知的新系统时，应制备一系列不同生物素化程度的红细胞（参见表III作为示例），以测试多种配体密度。稳态下的平均黏附概率不应超过0.8，因为细胞间受体密度的差异通常会导致部分细胞的黏附水平达到1，尤其是在平均配体密度过高的情况下。在初步特异性测试过程中，若发现某些细胞的黏附水平为0或1，则需调整配体密度。非特异性对照实验通常在特异性实验之后进行，此时应使黏附概率尽...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343 和 R01GM096187。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBSBioWhittaker

17-517Q

使用前用去离子水稀释至1倍浓度
Vacutainer EDTA BD 生物科学366643红细胞分离
10毫升 PK100
Histopaque 1077Sigma-Aldrich10771红细胞分离
腺嘌呤Sigma-AldrichA2786EAS-45 制备
D-葡萄糖（右旋糖）Sigma-AldrichG7528EAS-45 制备
D-甘露醇Sigma-Aldrich6360EAS-45 制备
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS7653EAS-45 制备
磷酸氢二钠（Na₂HPO₄)Fisher ScientificS374EAS-45 制备
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG5763EAS-45 制备
Biotin-X-NHSCalbiochem203188红细胞生物素标记
二甲基甲酰胺（DMF）赛默飞世尔科技公司20673红细胞生物素标记
硼酸盐缓冲液（0.1 M）电子显微镜科学公司11455-90红细胞生物素标记
链霉亲和素赛默飞世尔科技公司21125配体功能化
BSASigma-AldrichA0336配体功能化
Quantibrite PE 珠BD 生物科学340495密度定量
流式细胞仪BD 生物科学

BD LSR II

密度定量

毛细管

0.7-1.0 mm × 30"		Kimble Chase46485-1微移液管拉制
矿物油Fisher ScientificBP2629-1腔室组装
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-544-G腔室组装

PE α人 CD11a

克隆 HI 111 		eBioscience12-0119-71图1所用试剂
PE 抗人 CD54 eBioscience12-0549图1试剂
小鼠 IgG1 同型对照 PEeBioscience12-4714图1所用试剂
液压显微操作器Narishige InternationalMO-303微量移液系统
机械操作臂Newport Corp.461-xyz-m, SM-13, DM-13微量移液系统
压电–电动翻译器Physik InstrumentsP-840微量移液系统
LabVIEW国家仪器公司版本 8.6微量移液系统
数据采集板国家仪器公司USB-6008微量移液系统
光学平台动力学系统5200 系列微量移液系统

参考文献

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ICAM 1

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