本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。
本文内容
摘要
摘要
微移液管黏附实验于1998年开发，用于测量二维（2D）受体-配体结合动力学1。该实验采用人红细胞（RBC）作为黏附传感器，并作为其中一种相互作用分子的呈递细胞。通过显微操作技术，将红细胞与表达另一种相互作用分子的细胞进行接触，精确控制接触面积和接触时间，以促进分子间结合的形成。当将两个细胞拉开时，红细胞的伸长现象即指示了黏附事件的发生。通过调控固定在红细胞表面配体的密度，使黏附概率保持在0到1之间的中等范围。对于给定的接触时间，通过重复多次细胞接触循环，根据黏附事件发生的频率来估算黏附概率。改变接触时间可获得一条结合曲线。将受体-配体反应动力学的概率模型1拟合至该结合曲线，即可获得二维亲和力和解离速率。
该检测方法已通过以下相互作用得到验证：Fcγ受体与IgG Fc1-6、选择素与糖缀合物配体6-9、整合素与配体10-13、同嗜性钙黏蛋白结合14，以及T细胞受体及其共受体与肽-主要组织相容性复合物15-19的相互作用。
该方法已被用于量化生物物理因素对二维动力学的调控作用，例如膜微拓扑结构5、膜锚定方式2、分子取向和长度6、载体刚度9、曲率20以及碰撞力20，以及生化因素，例如细胞骨架和相互作用分子所处的膜微环境的调节因子，以及这些分子的表面组织方式15,17,19。
该方法还被用于研究双受体-配体物种的同步结合3,4，以及利用改进模型研究三分子相互作用1921。
该方法的主要优势在于能够在其天然膜环境中研究受体，所得结果可能与使用纯化受体获得的结果大不相同17。此外，该方法还能够在亚秒级时间尺度上研究受体-配体相互作用，其时间分辨率远超典型的生化方法。
为了说明微管黏附频率法，我们展示了红细胞上功能化的细胞间黏附分子1（ICAM-1）与中性粒细胞上的整合素αLβ2结合的动力学测量结果，实验溶液中加入二聚体E-选择素以激活αLβ2。
方案
1. 从全血中分离红细胞
- 配制 EAS-45 溶液。称取 表 I 中列出的所有成分，溶于 100–200 ml 去离子水中。加水定容至 1000 ml，并调节 pH 至 8.0。过滤后分装为每份 50 ml，于 -20°C 冷冻保存。
注意：步骤 1.2 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行。
- 从肘正中静脉抽取3-5ml血液至含有EDTA的10ml试管中，并立即轻柔充分混匀，使血液与EDTA充分混合，以防凝血。
- 尽快处理血样。除离心步骤外，以下所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持无菌状态。将血液转移至50ml离心管中，加入10ml冷且无菌的Histopaque 1077，于4°C、1000rpm离心5分钟。重复此步骤两次。
- 加入10ml冷且无菌的PBS，于4°C、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。重复该洗涤步骤4次（共5次）。
- 用无菌EAS-45洗涤两次（每次5分钟，4°C，1000rpm）。最后一次洗涤时，将红细胞转移至新的无菌15ml离心管中。
- 将红细胞重悬于10ml EAS-45中。
2. 红细胞生物素标记
- 取步骤1中装有红细胞（RBCs）的离心管，在4°C条件下以1000 rpm离心5分钟，弃去全部上清液。将10 μl红细胞沉淀分装至若干小管中，并向每管加入相应体积的PBS（参见表II，以制备六种不同生物素标记浓度的红细胞为例）。
- 根据表II所示方法，新鲜配制Biotin-X-NHS/DMF的1:10和1:100稀释液。
- 向每管中加入10 μl 0.1 M硼酸盐缓冲液。
- 向每管中加入计算好体积的生物素溶液（参见表II示例），并立即涡旋混匀。
- 将每管红细胞样品置于50 ml锥形离心管中，在室温下置于旋转仪上孵育30分钟。
- 用800 μl EAS-45洗涤每管样品3次，每次2分钟，2000 rpm离心。
- 向每管中加入100 μl EAS-45，4°C保存。最终溶液中每1 μl应含有约1×10⁶个红细胞。
3. 在红细胞上功能化生物素连接的配体*
- 根据制造商说明书配制 2mg/ml 的链霉亲和素溶液。分装后的溶液可在 -20°C 保存。
- 取步骤 2.7 中的红细胞（10μl）与链霉亲和素溶液等量混合，立即涡旋振荡，并在 4°C 条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。
- 用 500μl EAS-45 洗涤 3 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。
- 取步骤 3.3 中的红细胞（10μl）与 20μg/ml 配体溶液等量混合，立即涡旋振荡，并在室温下于旋转仪上孵育 30 分钟。
- 用 500μl EAS-45/1% BSA 洗涤 2 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。
*如果您的蛋白质没有生物素连接，可以使用市售的蛋白质生物素化试剂盒（例如，Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit），或如视频所示，使用生物素化捕获抗体作为中间步骤。
4. 受体与配体密度的定量分析
- 将第3步中配体包被的红细胞与另一管中表达受体的细胞分别与各自饱和浓度的单克隆抗体在室温下孵育30分钟。对照组则分别在不同的小管中用无关的同型匹配抗体孵育细胞。如果一抗未标记荧光，根据制造商说明书，再与荧光标记的二抗孵育。
- 采用相应的荧光校准微球，通过流式细胞术分析第4.1步制备的样品。按图1所示计算密度。
5. 玻璃微电极和细胞记录室的准备
- 使用 PN-30 Narishige 磁性玻璃微电极水平拉制仪或 Sutter Instruments 微移液管拉制仪，从毛细管中拉制微移液管。
- 使用带显微操作器的微电极加工仪调节拉制后的微移液管尖端至所需尺寸（通常所需直径范围为 1–5 μm，具体取决于实验中所用细胞的大小）。
- 通过将显微镜盖玻片切割至所需尺寸来制备细胞腔室。从两侧用石蜡油密封腔室，以防止培养基蒸发导致实验过程中渗透压改变。
- 将携带受体和配体的细胞加入腔室中。
6. 微管黏附频率测定
- 使用相应的移液器吸取相互作用的细胞，并利用计算机编程的压电驱动器控制红细胞与另一细胞接触和分离的过程，调节接触面积和接触时间。通过观察细胞分离时红细胞的拉伸现象来检测黏附事件。
- 对给定的接触时间重复接触-回缩循环50-100次。在Excel电子表格的一列中记录观察到的黏附事件：发生黏附记为“1”，无黏附记为“0”。可使用记录设备（如数字媒体或录像带）保存显微图像。
- 针对每个接触时间，使用至少三对不同的细胞记录黏附频率随接触时间变化的曲线，以获得均值和标准误（SEM）。
- 通过使用包被无关配体（如BSA）的红细胞和/或使用特异性功能阻断型单克隆抗体封闭配体或受体，记录对照组的非特异性结合曲线。每个接触时间点的特异性黏附频率可通过从总黏附频率中减去非特异性黏附频率得到1。
7. 数据分析
- 拟合特异性黏附频率 Pa 与接触时间 t 通过一个概率模型（公式1）描述单一种类受体与单一种类配体之间的二级正向和一级逆向单步相互作用的数据1:
![动态系统中概率的方程；公式：P_a = 1-exp{-m_mg_AK_a[1-exp(-k_oft)]}](/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg "figure-protocol-1")
其中 Ka 是二维有效结合亲和力， k关闭 是解离速率， mr 和 ml 分别为步骤4中测得的受体和配体密度，以及 Ac 是接触面积。曲线拟合有两个参数， AcKa 和 k关闭，作为 Ac 和 Ka 被归为一类，统称为有效二维亲和力。其与解离速率的乘积即为有效二维结合速率： Ack在 = AcKa x k关闭.
特异性黏附频率 Pa 通过减去非特异性黏附组分（P非特异性) 从总测量黏附力中（P测量)1,21:
8. 代表性结果：
图 1 中性粒细胞上整合素 αLβ2 位点密度的测定。中性粒细胞首先在 1 μg/mL 的 E-选择素-Ig 中孵育 10 分钟，以匹配图 3 和图 4 所用的实验条件，或不加 E-选择素-Ig 作为对照，随后在饱和浓度（10 μg/mL）下与 PE 标记的抗人 CD11a 单克隆抗体（克隆号 HI111，参见试剂与设备表）或无关小鼠 IgG1（对照）孵育，洗涤后立即进行分析。样品使用 BD LSR 流式细胞仪检测，并采用标准 QuantiBRITE PE 校准微球进行校准。图 A 显示了校准微球（粉红色）以及经 E-选择素-Ig 处理（蓝色）或未处理细胞（绿色）的荧光直方图。特异性 CD11a 单抗染色以实线表示，同型匹配的无关对照抗体染色以虚线表示。在整个洗涤步骤及 FACS 缓冲液中均含有 E-选择素-Ig 的细胞处理，未影响 CD11a 密度，这一点通过与未处理细胞的比较可见。图 B 显示了密度定量的过程。根据图 A 中四个校准微球直方图的每个峰的平均荧光强度（FI）（粉红色圆圈）及其对应的每颗微球所含 PE 分子数（由生产商提供），计算其 Log10 值。以每颗微球的 Log10 PE 分子数为纵坐标，Log10 荧光强度为横坐标，绘制线性回归曲线。对于经 E-选择素处理的细胞，特异性单抗和对照抗体的 Log10 FI（y）值分别为 3.99（蓝色实心圆）和 2.23（蓝色空心圆）。通过该线性方程求解 x 值（结果以绿色和蓝色圆圈标注于图 B）。其中 x = Log10 PE/细胞，由于 PE 与单抗的比例为 1:1，因此中性粒细胞表面 αLβ2 的总数计算为 9587。利用中性粒细胞直径为 8.4 μm 的假设22，计算得表面密度为 43 个分子/μm2。ICAM-1 的密度同样通过流式细胞术测定，使用 PE 标记的抗人 CD54 单克隆抗体，结果为 65 分子/μm2。
图 2 显微操作针系统示意图。我们的显微操作针系统为自行组装，包含三个子系统：成像子系统，用于观察、记录和分析被显微操作针吸住的细胞的运动；显微操作子系统，用于从细胞室中选择细胞；以及压力子系统，用于将细胞吸入显微操作针中。成像子系统的核心是一台倒置显微镜（Olympus IMT-2 IMT2），配备100倍油镜物镜（数值孔径1.25 N.A.）。图像通过电荷耦合器件（CCD）相机传输至录像机。系统连接了视频计时器以记录时间。每个显微操作针可通过安装在显微镜上的机械驱动装置进行操控，并借助三轴液压显微操纵器进行精细定位。也可使用Newport公司的机械操纵器。其中一个显微操作针支架安装在压电平移器上，其驱动器由计算机LabView程序（可应要求提供）控制，信号经由数据采集板（DAQ）和电压放大器（自制）传递至压电执行器。这使得在黏附力测试循环中能够精确且可重复地移动移液针。压力调节子系统用于在实验过程中控制负压。液压管路将显微操作针支架连接至液体储液器，通过精密机械定位器可精确调节储液器的高度。
使用KIMAX熔点测定用硼硅酸盐玻璃毛细管（外径为1.0±0.07 mm，内径为0.7±0.07 mm）制备微量移液器。首先，利用Narishige PN-30型磁性玻璃微电极水平拉制仪（Sutter Instruments微量移液器拉制仪为另一种可选设备）将毛细管拉制成微量移液器。其次，使用自制显微操作仪将微量移液器切割至所需口径大小。此外，也可使用 commercially available 的显微操作仪设备。
为避免实验过程中微量移液器产生振动，将显微镜连同显微操作器一同置于气浮台上。
图3 红细胞分别包被ICAM-1（A）或hIgG（B）后，与表达整合素αLβ2的人中性粒细胞在1秒（红色）和10秒（蓝色）接触时间下，经过多次黏附测试循环测得的特异性（A）和非特异性（B）黏附的运行频率 Fi。Fi = (X1 + X2 +…+ Xi)/i （1 ≤i ≤ n），其中 i 为测试循环序号，Xi 取值为“1”（发生黏附）或“0”（无黏附）。以 Fn（n=50）作为黏附概率的最佳估计值。
图4 ICAM-1 与中性粒细胞整合素 α 结合动力学Lβ2 (
). 如图3所示，针对每种接触时间的三组细胞对测量得到的黏附概率取平均值，并绘制为接触时间的函数。腔室中的培养基为含1 mM Ca的HBSS2+ 和 Mg2+ 加 1μg/ml 二聚体E-选择素-Ig上调αLβ2 结合。为了在红细胞（RBCs）上捕获ICAM-1-Ig，增加了一个中间步骤，即将RBCs与 10μg/ml 捕获抗体（生物素化山羊抗人Fc抗体，eBioscience）在链霉亲和素孵育步骤之后使用。为控制非特异性结合，设置了两种不同条件：1）红细胞包被抗人Fc捕获抗体后，与人IgG孵育而非ICAM-1-Ig（O）；2）中性粒细胞与未包被捕获抗体的红细胞结合（Δ）。 10μg/ml 向培养基中加入人IgG，以最大限度减少溶液中E-选择素-Ig与红细胞表面捕获抗体的非特异性结合。以人IgG作为对照曲线记录的非特异性结合用于获得特异性黏附概率曲线。
) 使用公式 2 计算。使用公式 1（实线）拟合特异性黏附概率曲线，得到有效结合亲和力 AcKa = 1.4•10-4 μm4 和 k关闭 = 0.3 s-1.
| 试剂 | 分子量 (g/mol) | 浓度 (mM) | 用量 (g) |
|---|---|---|---|
| Adenine | 135.13 | 2 | 0.27 |
| D-glucose (dextrose) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D-Mannitol | 182.17 | 55 | 10.02 |
| Sodium Chloride (NaCl) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na HPO ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L-glutamine | 146.15 | 10 | 1.46 |
表1. EAS-45缓冲液配制（1L）。
| 550 μl DMF 中的 25 mg 生物素-XHS | 0.1M 生物素溶液 |
| 用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 10 倍 | 0.01M 生物素溶液 |
| 用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 100 倍 | 0.001M 生物素溶液 |
表2. 生物素溶液的配制。
| 生物素终浓度 (μM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 红细胞沉淀储备液 (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (μl) | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1M 硼酸盐缓冲液 (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M 生物素溶液 (μl) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001M 生物素溶液 (μl) | 0.8 | 2 | 4 |
表3. 红细胞的生物素标记。
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讨论
为了成功使用微管黏附频率测定法，应考虑几个关键步骤。首先，务必记录所关注的受体-配体系统之间的特异性相互作用。非特异性对照测量（参见图3、图4）可确保特异性。理想情况下，所有接触时间下的非特异性黏附概率应低于0.05，并且在每个时间点上，特异性与非特异性黏附概率之间应存在显著差异。可采用不同的方法将配体偶联到红细胞表面。已有研究表明，与生物素-链霉亲和素偶联法相比，氯化铬偶联法17会导致更高的非特异性结合水平。
其次，特异性相互作用的黏附概率应处于中等范围。这一要求可通过调整受体和配体的密度来满足（如果细胞上的受体为组成型表达且其密度难以改变，则可仅调整红细胞上的配体密度）。为此，在测试受体-配体结合亲和力未知的新系统时，应制备一系列不同生物素化程度的红细胞（参见表III作为示例），以测试多种配体密度。稳态下的平均黏附概率不应超过0.8，因为细胞间受体密度的差异通常会导致部分细胞的黏附水平达到1，尤其是在平均配体密度过高的情况下。在初步特异性测试过程中，若发现部分细胞的黏附水平为0或1，则需调整配体密度。非特异性对照实验通常在特异性实验之后进行，此时希望黏附概...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343 和 R01GM096187。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q | 使用前用去离子水稀释至1倍浓度 |
| Vacutainer EDTA | BD 生物科学 | 366643 | 红细胞分离 |
| 10毫升 PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 红细胞分离 |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 制备 |
| D-葡萄糖（右旋糖） | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 制备 |
| D-甘露醇 | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 制备 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 制备 |
| 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 制备 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 制备 |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | 红细胞生物素标记 |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | 赛默飞世尔科技公司 | 20673 | 红细胞生物素标记 |
| 硼酸盐缓冲液（0.1 M） | 电子显微镜科学公司 | 11455-90 | 红细胞生物素标记 |
| 链霉亲和素 | 赛默飞世尔科技公司 | 21125 | 配体功能化 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | 配体功能化 |
| Quantibrite PE 珠 | BD 生物科学 | 340495 | 密度定量 |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | BD LSR II | 密度定量 |
毛细管 0.7-1.0 mm × 30" | Kimble Chase | 46485-1 | 微移液管拉制 |
| 矿物油 | Fisher Scientific | BP2629-1 | 腔室组装 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-G | 腔室组装 |
PE α人 CD11a 克隆 HI 111 | eBioscience | 12-0119-71 | 图1所用试剂 |
| PE 抗人 CD54 | eBioscience | 12-0549 | 图1试剂 |
| 小鼠 IgG1 同型对照 PE | eBioscience | 12-4714 | 图1所用试剂 |
| 液压显微操作器 | Narishige International | MO-303 | 微量移液系统 |
| 机械操作臂 | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | 微量移液系统 |
| 压电–电动翻译器 | Physik Instruments | P-840 | 微量移液系统 |
| LabVIEW | 国家仪器公司 | 版本 8.6 | 微量移液系统 |
| 数据采集板 | 国家仪器公司 | USB-6008 | 微量移液系统 |
| 光学平台 | 动力学系统 | 5200 系列 | 微量移液系统 |
参考文献
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