诱导培养的交感神经元树突生长

摘要

我们描述了一种利用骨形态发生蛋白-7（BMP-7）或Matrigel选择性诱导新生大鼠颈上神经节（SCG）分离的原代交感神经元树突生长的实验方案。

摘要

树突分支的形态决定了神经元能够接收的总突触输入量^1-3，并影响这些输入的类型和分布^4-6。在实验模型中，树突生长和可塑性的异常模式与神经行为功能受损相关⁷，并被认为有助于解释神经发育障碍^8-10和神经退行性疾病^11-13中所观察到的临床症状。这些发现凸显了精确调控树突形态的功能重要性，并提示：揭示调控树突生长的机制，不仅有助于深入理解正常发育过程中神经元连接性的调控方式，还可能为多种神经系统疾病的新型治疗策略提供线索。

研究树突生长的机制将因拥有一个合适的模型系统而大为便利，该系统可使神经元在实验条件下从不延伸树突的状态转变为能够形成与体内神经元相当的复杂树突分支结构的状态 体内 对应物。从围产期啮齿类动物颈上神经节（SCG）分离得到的交感神经元原代培养为此类模型提供了理想选择。当在无血清且不含神经节胶质细胞的限定培养基中培养时，交感神经元仅延伸出一个轴突样的突起，且这种单极状态可在体外持续数周至数月。 ^14,15。然而，加入骨形态发生蛋白-7（BMP-7） ^16,17 或 Matrigel ¹⁸ 添加至培养基中可诱导这些神经元延伸出多个突起，这些突起在形态学、生物化学和功能上均符合树突的标准。从围产期啮齿类动物颈上神经节（SCG）分离并在确定条件下培养的交感神经元，是一类具有同质性的神经元群体。 ¹⁹ 对Matrigel、BMP-7以及decapentaplegic（dpp）和60A亚家族其他BMP的促进树突活性具有均一反应 ^17,18,20,21重要的是，Matrigel 和 BMP 诱导的树突形成并不伴随细胞存活率或轴突生长的变化 ^17,18.

本文介绍了如何建立源自新生大鼠颈上交感神经节（SCG）的离体培养交感神经元，使其能够响应Matrigel或骨形态发生蛋白（BMPs）选择性促进树突生长的活性。

方案

1. 培养基（C2 培养基）的制备

1. 按以下顺序，将下列成分加入一个无菌的一次性 500 ml 锥形瓶中： ....

   体积	成分	终浓度
   190 ml	DMEM（低糖）	N/A
   10 ml	脂肪酸-free BSA（20mg/ml 溶于 DMEM）	50 μg/ml
   2.8 ml	L-谷氨酰胺	1.4 mM
   4 ml	胰岛素/转铁蛋白/硒（100 倍）	10 μg/ml 胰岛素，5.5 μg/ml 转铁蛋白，38.7 nM 硒
   0.4 ml	NGF（125 μg/ml）	100 ng/ml

讨论

该模型的优点包括：(a) 培养物由均一的交感神经元群体组成，不含其他类型的细胞^17,23；(b) 交感神经元的生长因子需求已明确，因此可使用成分明确的培养基，且多种成分明确的培养基和基质均适用于交感神经元的培养与维持²³；(c) 这些培养物中的神经元对Matrigel、BMP-7以及dpp和60A亚家族其他BMPs的促进树突活性表现出一致的反应^17,18,20,21；(d) Matrigel或BMP诱导的树突形成过程不伴随细胞存活率或轴突生长的变化^17,18。该模型可实验性地控制树突生长的启动时机，从而可以获得处于不同树突生长阶段的同步化神经元群体，例如在树突形成前、初级树突生成期（初级树突的初始形成）以及树突成熟后期。该模型最主要的局限性在于，单次常规分离一窝动物所获得的RNA和蛋白质数量有限，可能限制生化研究，同时在基因表达操控方面存在一定困难。近年来，在原代神经元培养中表达cDNA的技术不断进步，正在迅速克服后一缺点。已有文献报道成功应用脂质体递送系统、核转染（nucleofection）以及腺病毒载体对培养的交感神经元进行基因转染。报道的转染.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃盖玻片	Bellco Glass	1943-10012	12 mm 圆形盖玻片，1号厚度，德国玻璃
弯头吸管	Bellco Glass	1273-50003
多聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P0899-100MG	储存液浓度 1 mg/ml
蒸馏水	GIBCO, by Life Technologies	15230
精细镊子 Dumont 4号和5号	Fine Science Tools	11252-30 11241-30
20号针头	BD Biosciences	305176
Leibovitz’s L-15 培养基	Invitrogen	11415
胶原酶	Worthington Biochemical	4176	1 mg/ml
中性蛋白酶	Roche Group	04942078001	5 mg/ml
Hank’s 平衡盐溶液（无钙、无镁）	Invitrogen	14185-052
DMEM 低糖培养基	Invitrogen	11885
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030	20 mM
胰岛素/转铁蛋白/硒	Invitrogen	51500-056	100X
无脂肪酸牛血清白蛋白	Calbiochem	126609
神经生长因子（NGF）	Harlan Laboratories	5017
Ham F-12 营养培养基（F-12）	Invitrogen	11765
阿糖胞苷	Sigma-Aldrich	C1768
Matrigel	BD Biosciences	356234	避免反复冻融
BMP-7	R&D Systems	345-BP BMP7-07H	BMP-4、BMP-5 和 BMP-6 与 BMP-7 效果相当，且有时在商业上更容易获得
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
曲拉通 X-100	Fisher Scientific	BP151-500
小鼠抗大鼠 MAP2 抗体	Sternberger Monoclonals Inc.	SMI52	1/5000
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠抗体	Invitrogen	A11003	1/10000
封片介质	Molecular Probes, Life Technologies	P7481