我们描述了一种利用骨形态发生蛋白-7（BMP-7）或Matrigel选择性诱导新生大鼠颈上神经节（SCG）分离的原代交感神经元树突生长的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
树突分支的形态决定了神经元能够接收的总突触输入量1-3，并影响这些输入的类型和分布4-6。在实验模型中，树突生长和可塑性的异常模式与神经行为功能受损相关7，并被认为有助于解释神经发育障碍8-10和神经退行性疾病11-13中所观察到的临床症状。这些发现凸显了精确调控树突形态的功能重要性，并提示：揭示调控树突生长的机制，不仅有助于深入理解正常发育过程中神经元连接性的调控方式，还可能为多种神经系统疾病的新型治疗策略提供线索。
研究树突生长的机制将因拥有一个合适的模型系统而大为便利，该系统可使神经元在实验条件下从不延伸树突的状态转变为能够形成与体内神经元相当的复杂树突分支结构的状态 体内 对应物。从围产期啮齿类动物颈上神经节（SCG）分离得到的交感神经元原代培养为此类模型提供了理想选择。当在无血清且不含神经节胶质细胞的限定培养基中培养时，交感神经元仅延伸出一个轴突样的突起，且这种单极状态可在体外持续数周至数月。 14,15。然而，加入骨形态发生蛋白-7（BMP-7） 16,17 或 Matrigel 18 添加至培养基中可诱导这些神经元延伸出多个突起，这些突起在形态学、生物化学和功能上均符合树突的标准。从围产期啮齿类动物颈上神经节（SCG）分离并在确定条件下培养的交感神经元，是一类具有同质性的神经元群体。 19 对Matrigel、BMP-7以及decapentaplegic（dpp）和60A亚家族其他BMP的促进树突活性具有均一反应 17,18,20,21重要的是，Matrigel 和 BMP 诱导的树突形成并不伴随细胞存活率或轴突生长的变化 17,18.
本文介绍了如何建立源自新生大鼠颈上交感神经节（SCG）的离体培养交感神经元，使其能够响应Matrigel或骨形态发生蛋白（BMPs）选择性促进树突生长的活性。
方案
1. 培养基（C2 培养基）的制备
- 按以下顺序，将下列成分加入一个无菌的一次性 500 ml 锥形瓶中：
体积 成分 终浓度 190 ml DMEM（低糖） N/A 10 ml 脂肪酸-free BSA（20mg/ml 溶于 DMEM） 50 μg/ml 2.8 ml L-谷氨酰胺 1.4 mM 4 ml 胰岛素/转铁蛋白/硒（100 倍） 10 μg/ml 胰岛素，5.5 μg/ml 转铁蛋白，38.7 nM 硒 0.4 ml NGF（125 μg/ml） 100 ng/ml 200 ml Ham F-12 N/A - 轻轻旋转混匀，并将溶液分装至 17 x 100 无菌带盖试管中，每管 10 ml。
- 于 -80 °C 保存
- 重要注意事项：
- 使用前立即解冻 NGF。
- 在分装 NGF 储存液前，需用蛋白预润洗组织培养级塑料移液管内壁，以减少 NGF 与塑料表面的结合。最简便的方法是先用含 BSA 的 DMEM 混合液反复吹打数次。再用该 DMEM 混合液冲洗 NGF 管数次。
- 最后加入 F-12，因为游离的半胱氨酸可能破坏胰岛素中的二硫键。
- 避免将溶液冷冻成大于 10 ml 的体积，以防生成 CaPO4 晶体。
- C2 培养基的冻融次数不得超过 2 次。
2. 玻璃盖玻片的准备
- 我们发现，只有优质的德国玻璃盖玻片在此方案中能保持一致的效果（推荐的来源和目录号见表1）。
- 在300 ml的玻璃样品瓶中加入75–100 ml的70%硝酸，瓶盖内衬需为聚四氟乙烯（PTFE或Teflon）材质（Fisher目录号#09-911-765）。
- 佩戴手套，将盖玻片逐片放入硝酸溶液中。加入足够数量的盖玻片，使其在瓶底形成不超过2–3层的薄层。
- 将装有盖玻片的容器置于摇床（转速不超过185 rpm）上，在室温下轻轻震荡6–8小时。
- 在通风橱中操作，小心倾去酸液，并按照当地规定妥善处理。先用超纯组织培养级水冲洗盖玻片一次，然后向容器中加入75–100 ml水。若水变浑浊，可多次冲洗。在室温下，将容器置于摇床（转速不超过185 rpm）上轻轻震荡过夜。
- 每日重复上述硝酸/组织培养级水处理步骤，共进行3天。
- 倒去最后一次的组织培养级水，加入足量丙酮，使其刚好覆盖盖玻片。
- 倾去该批丙酮，并妥善处理。
- 将盖玻片转移至150 mm的玻璃培养皿中。加入足量丙酮，使其刚好覆盖盖玻片。确保盖玻片在培养皿中呈单层分布。
- 在通风橱中静置过夜，使丙酮完全挥发。
- 将盖玻片置于烘箱中，在180 °C下烘烤1.5小时以达到灭菌效果。
3. 培养用盖玻片的准备
- 解剖前一天，使用无菌操作技术将1片盖玻片（按上述方法制备）放入24孔组织培养板的每个孔中。向每孔加入200 μl无菌的多聚赖氨酸溶液（100 mg/ml溶于0.5 M Tris缓冲液，pH 8），并将培养板置于4 °C过夜孵育。
- 解剖当天，最好在开始解剖前，吸除各孔中的多聚赖氨酸溶液，并用无菌组织培养级水洗涤每个孔5次。
- 向每孔加入200 μl低糖DMEM培养基，并将培养板置于37 °C培养箱中。在接种细胞前约1小时，移除低糖DMEM培养基，每孔加入250 μl C2培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至细胞准备接种。
4. 颈上神经节的解剖与分离
- 通常通过分离产前（胚胎第19-21天）大鼠幼崽的颈上神经节（SCG）来制备交感神经元的离体培养物，因为此来源的胶质细胞较少。然而，本方案同样可成功用于出生后早期（1至3日龄）大鼠幼崽或围产期小鼠幼崽。
- 通过吸入 CO2 处死怀孕大鼠。剃除腹部毛发，并用70%乙醇清洗皮肤。在无菌条件下取出子宫角，并将子宫角置于无菌的150 mm培养皿中。解剖过程中应避免损伤母体的肠道或其他内脏器官。
- 将带有幼崽的培养皿置于冰盘上，以冰麻醉胚胎期幼崽。将胚胎从子宫角和羊膜中分离出来。在肩部中线处切断每个幼崽的脊髓以实施安乐死。此操作同时切断下腔静脉，可减少在解剖SCG过程中颈动脉的出血。一旦从子宫角中分离出胚胎，立即将其放入含青霉素和链霉素的无菌Leibovitz's L-15培养基（或任何空气缓冲培养基）中。
- 将胚胎仰卧置于盛有Sylgard的150 mm培养皿中。使用无菌20号针头固定胸部和头部，轻柔地过度伸展颈部，以利于SCG的解剖。
- 在锁骨水平沿颈部正中做切口，暴露下颌下腺。使用精细镊子（Dumont no. 4 或 no. 5）移除下颌下腺，以暴露肌层。
- 使用精细镊子在靠近锁骨处剪断胸锁乳突肌。然后轻柔提起并切开气管旁的肩胛舌骨肌。该肌肉非常薄，操作时应避免过深切割，以防撕裂其下方的颈动脉和SCG。去除这些肌层后，颈动脉和迷走神经应清晰可见。
- SCG位于颈动脉分叉的正下方。使用精细镊子（no. 4 或 no. 5）钝性剥离颈动脉两侧的组织，以暴露神经节。使用两把精细镊子，分别夹住SCG头侧和尾侧上方的颈动脉，从而移除位于SCG上方的一段颈动脉及SCG本身。在此发育阶段，与SCG并行的结状神经节也可能在此步骤中被一并移除。结状神经节可通过其圆形形态及从中发出的粗大迷走神经进行识别，它位于颈动脉的一个分支旁。相比之下，SCG呈杏仁状，位于颈动脉分叉正下方。将解剖所得组织放入含L-15培养基和抗生素的无菌35 mm培养皿中。在进行后续步骤前，需完成所有幼崽SCG的采集。
- 使用精细镊子轻柔地将SCG从颈动脉及其他伴随组织（特别是迷走神经和结状神经节）中分离。用精细镊子去除神经节的被膜，这可显著减少培养中的非神经元细胞数量。将神经节转移至另一含L-15培养基的无菌35 mm培养皿中。
- 为解离SCG，吸除L-15培养基，并加入2 ml含胶原酶（终浓度1 mg/ml）和Dispase（终浓度5 mg/ml）的无钙镁Hank's平衡盐溶液。在37 °C下孵育40分钟。
- 将SCG转移至无菌15 ml锥形离心管中，加入含BSA（终浓度1-2 mg/ml）的L-15培养基至总体积10 ml。在室温下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，并用含BSA的L-15培养基再清洗一次。
- 第二次清洗后，吸除所有L-15培养基，将神经节重悬于约2 ml C2培养基中。使用经火焰抛光的弯头移液管进行吹打解离；吹打前确保移液管已用BSA/L15预处理，以减少细胞粘附。轻柔吹打3-4次。静置约1分钟，待大块组织沉淀后，将细胞悬液转移至15 ml锥形管中。向残留的SCG中加入更多C2培养基并再次吹打。待大块沉淀后，将第二次吹打所得细胞悬液合并至第一次收集的悬液中。重复此过程数次，直至神经节基本解离。第四次吹打后，弃去任何残留的大块组织。
- 对于来自一窝大鼠幼崽（通常12-16只）解离所得的细胞，通过添加C2培养基将细胞悬液总体积调至8-10 ml。轻柔吹打重悬细胞，取少量样液测定细胞密度。调整细胞悬液体积，使其细胞密度为培养所需密度的2倍；然后确保细胞保持悬浮状态，每孔分装250 µl细胞悬液。在树突发育形态学研究中，我们通常以低密度（约5 × 104 个细胞/孔）将细胞接种于24孔板中。
- 本实验室采用玻璃干燥器而非直接使用CO2培养箱来孵育SCG培养物。这是因为使用无血清培养基培养的交感神经元在稍高CO2浓度（约6.5%）下表现更佳。此外，我们不在培养基中使用抗生素，因其会抑制神经突生长；而将培养物置于干燥器中似乎可限制污染在部分培养物中扩散。采用此系统，我们通常可将SCG培养物维持长达8周。接种后，将SCG培养物置于玻璃干燥器内的瓷质托盘上，干燥器底部盛有无菌水。在密封干燥器前，向其中注入约120 ml CO2，然后将整个干燥器放入设定为35.5 °C的培养箱中。
5. 培养物的喂养与维持
- 通常每周换液三次，首次换液在铺板后24小时进行。使用无菌弯头移液管，轻柔吸出每孔约一半的培养基。使用新的无菌弯头移液管，补充等体积的新鲜C2培养基。
- 为清除培养物中的非神经元细胞，通常在首次换液时（例如铺板后24小时）向培养基中加入抗有丝分裂试剂阿糖胞苷（cytosine-D-arabinofuranoside，ARA-C，终浓度为1–2 μM），作用48小时。该浓度的ARA-C通常足以清除所有非神经元细胞。若需额外处理，建议每隔一次换液进行一次ARA-C处理，以尽量减少对神经元的毒性作用。
6. 使用 Matrigel 或 BMP-7 诱导树突生长
- 为诱导树突生长，在消除非神经元细胞且培养物中 Ara-C 浓度显著降低后，向培养物中添加 Matrigel 或 BMP-7。通常我们在第 5 天将 Matrigel 或 BMP-7 加入培养基中 体外，但无论何时添加Matrigel或BMP-7，均可诱导树突生长 体外在C2培养基中加入Matrigel或BMP-7，并按上述方法进行培养和换液。
- Matrigel 和 BMP 诱导的树突生长具有时间和浓度依赖性。为达到最大效应，Matrigel 以终浓度 50-75 μg/ml；BMP-7 加入 C2 培养基中，终浓度为 50 ng/ml。Matrigel 浓度高于 100 μg/ml 或当BMP-7浓度高于100 ng/ml时，已被发现可引起神经元毒性。在使用Matrigel或BMP-7达到最大有效浓度处理后约48小时，可依据形态学标准观察到树突结构的出现。为诱导显著的树突生长，每次换液时均需用含BMP-7的培养基对培养物进行换液。使用BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6在相似浓度下亦可获得相当的效果 20,21.
7. BMP-7诱导的树突生长的免疫细胞化学分析
- 当树突分支达到所需程度时，使用含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液固定培养物。最佳固定效果可通过将孔中一半培养基替换为4%多聚甲醛，并在10–15分钟内重复此步骤3–5次来实现。
- 通过将4%多聚甲醛溶液的一半替换为磷酸盐缓冲液（PBS），并在10–15分钟内重复该步骤三次，清洗培养物。
- 移除所有PBS，每孔加入200 μl含0.1% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟以通透细胞。
- 吸除Triton溶液，每孔加入200 μl封闭缓冲液（PBS中添加3–5% BSA和1%羊血清），室温孵育20–30分钟。
- 移除封闭液，加入用封闭缓冲液按1:2000–1:5000稀释的一抗——微管相关蛋白-2（MAP2），室温孵育1小时或4 °C过夜。
- 移除一抗溶液，室温下用PBS清洗培养物，15分钟内重复清洗三次。
- 在避光条件下，室温下用含1% BSA的PBS稀释的二抗孵育培养物1–2小时。
- 移除二抗溶液，在避光条件下，室温下用PBS清洗培养物，10–15分钟内重复清洗三次。
- 将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，滴加适量pH值适合二抗所标记荧光染料的水性封片剂。将载玻片于室温放置过夜，使封片剂干燥。成像前将载玻片储存在4 °C。
- 成像前使载玻片恢复至室温。使用配备落射荧光装置的相差显微镜采集荧光图像。通常，使用20X物镜及合适的滤光片即可完整捕获单个神经元的全部树突分支结构。
8. 代表性结果
从围产期大鼠颈上神经节（SCG）分离的交感神经元，在无血清且无神经节胶质细胞的条件下培养时，无法延伸出MAP2免疫阳性突起。图1），但通常仅延伸出一条轴突过程 14,15. 暴露于BMP-7（图1）或Matrigel可诱导形成大量符合树突形态学、生物化学及功能标准的突起结构 17,18Matrigel 或 BMP-7 促进树突生长的活性具有浓度和时间依赖性 17,18,20. 使用50至100之间的Matrigel浓度可观察到最大程度的树突生长 75 μg/ml 或在30至100 ng/ml浓度范围内的BMP-7，通常在BMP-7浓度约为2 ng/ml时观察到半最大效应。然而，在低至300 pg/ml的BMP-7浓度下即可检测到树突生长的显著变化。无论是对Matrigel还是BMP-7的树突反应均相对较慢， <暴露于任一种促进树突形成的试剂后24小时内，有50%的神经元形成第二个突起。然而，在初次暴露于BMP-7后的3天内，几乎所有神经元均对最大有效浓度的Matrigel或BMP-7产生反应。持续暴露于BMP-7时，每 neuron 的树突数量持续增加，其中大部分变化发生在治疗的前10天内。经过4周后，经BMP-7处理的神经元通常具有6–8条初级树突，并呈现出二级、三级甚至四级树突分支。 17这种树突分支的增加并不伴随任何显著的轴突生长变化，且使用相似浓度的BMP 2、4、5或6也可引发类似的树突反应。 20,21. 通过将交感神经元与内源性神经节胶质细胞共培养，也可诱导树突生长 15,22然而，在这些条件下，树突反应显著较慢。
图1。 BMP-7 促进培养的交感神经元树突生长. 通过在第2天开始使用抗有丝分裂剂处理48小时，从颈上神经节（SCG）培养物中清除非神经元细胞 体外从第5天开始 体外培养物分别用对照培养基（A）或添加50 ng/ml BMP-7的培养基（B）处理。体外培养第11天（BMP处理5天后），用针对MAP2的单克隆抗体对培养物进行免疫荧光染色，MAP2是一种主要存在于树突和神经元胞体中的蛋白质。代表性荧光显微照片显示，在对照条件下培养的神经元缺乏树突，表现为无MAP-2免疫阳性突起（A）；相比之下，经BMP-7处理的神经元（B）通常具有多个细长的MAP-2免疫阳性树突。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该模型的优点包括：(a) 培养物由均一的交感神经元群体组成，不含其他类型的细胞17,23；(b) 交感神经元的生长因子需求已明确，因此可使用成分明确的培养基，且多种成分明确的培养基和基质均适用于交感神经元的培养与维持23；(c) 这些培养物中的神经元对Matrigel、BMP-7以及dpp和60A亚家族其他BMPs的促进树突活性表现出一致的反应17,18,20,21；(d) Matrigel或BMP诱导的树突形成过程不伴随细胞存活率或轴突生长的变化17,18。该模型可实验性地控制树突生长的启动时机，从而可以获得处于不同树突生长阶段的同步化神经元群体，例如在树突形成前、初级树突生成期（初级树突的初始形成）以及树突成熟后期。该模型最主要的局限性在于，单次常规分离一窝动物所获得的RNA和蛋白质数量有限，可能限制生化研究，同时在基因表达操控方面存在一定困难。近年来，在原代神经元培养中表达cDNA的技术不断进步，正在迅速克服后一缺点。已有文献报道成功应用脂质体递送系统、核转染（nucleofection）以及腺病毒载体对培养的交感神经元进行基因转染。报道的转染...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（资助号 R21 NS45037 和 R01 ES014901）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃盖玻片 | Bellco Glass | 1943-10012 | 12 mm 圆形盖玻片，1号厚度，德国玻璃 |
| 弯头吸管 | Bellco Glass | 1273-50003 | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P0899-100MG | 储存液浓度 1 mg/ml |
| 蒸馏水 | GIBCO, by Life Technologies | 15230 | |
| 精细镊子 Dumont 4号和5号 | Fine Science Tools | 11252-30 11241-30 | |
| 20号针头 | BD Biosciences | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 培养基 | Invitrogen | 11415 | |
| 胶原酶 | Worthington Biochemical | 4176 | 1 mg/ml |
| 中性蛋白酶 | Roche Group | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s 平衡盐溶液（无钙、无镁） | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM 低糖培养基 | Invitrogen | 11885 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| 胰岛素/转铁蛋白/硒 | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白 | Calbiochem | 126609 | |
| 神经生长因子（NGF） | Harlan Laboratories | 5017 | |
| Ham F-12 营养培养基（F-12） | Invitrogen | 11765 | |
| 阿糖胞苷 | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | 避免反复冻融 |
| BMP-7 | R&D Systems | 345-BP BMP7-07H | BMP-4、BMP-5 和 BMP-6 与 BMP-7 效果相当，且有时在商业上更容易获得 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 曲拉通 X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 小鼠抗大鼠 MAP2 抗体 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| 封片介质 | Molecular Probes, Life Technologies | P7481 |
参考文献
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
