VisioTracker 是一种自动化系统，通过记录幼体及小型成年鱼类的眼球运动，实现对其视觉功能的定量分析。该系统可完全控制视觉刺激参数，并具备实时分析能力，适用于视觉系统发育与功能、药理学、神经环路研究以及感觉运动整合等领域的高通量研究。
本文内容
摘要
摘要
研究视觉系统的发育与功能需要具有可量化、易于诱发、稳定且便于操控的视觉行为模型。一个合适的模型是视动反应（OKR），这是一种存在于所有脊椎动物中的反射性行为，因其具有高度的选择价值而被保留。OKR包括缓慢跟随刺激的眼球运动，随后交替出现快速复位的扫视眼动。由于斑马鱼幼虫的视动反应出现早且稳定（受精后96小时即完全发育），加之数十年来对斑马鱼遗传学的深入研究，使其成为该领域最受欢迎的模式生物之一，因此对该行为的测量在斑马鱼幼虫中易于实施。与此同时，对成年鱼类类似机制的研究也日益重要，尤其在药理学和毒理学应用方面。
本文介绍了VisioTracker，一种完全自动化、高通量的视觉功能定量分析系统。该系统基于Stephan Neuhauss教授课题组的研究成果，并由TSE Systems公司重新设计。系统包含一个用于固定小型鱼类的装置，由配备高分辨率变焦镜头的高质量摄像机进行监测。鱼缸周围环绕着一个圆筒形屏幕，可在其上投射计算机生成的刺激图案。眼动被实时记录，并由VisioTracker软件包自动实时分析。
数据分析能够即时识别出慢相和快相持续时间、运动周期频率、慢相增益、视敏度以及对比敏感度等参数。
典型结果可实现例如快速鉴定视觉系统突变体，这些突变体在野生型形态上无明显改变，或定量确定药理学、毒性和诱变剂对视觉系统功能的影响。
方案
1. 鱼类繁殖
胚胎在标准条件下（Brand 2002）培养和饲养，并根据受精后天数（dpf）进行发育阶段划分。实验所用成体及5 dpf幼鱼用于测量。
2. 实验步骤
- 仪器准备
幼鱼：将鱼类幼鱼置于预热至28°C的3%甲基纤维素中，以防止身体移动。将胚胎背侧朝上放置于VisioTracker中，面向投影屏幕。成年鱼：将鱼类在300 mg/L MS-222中短暂麻醉后，固定于固定装置中，并置于VisioTracker内。在开始测量前，使其恢复1-2分钟。
- 刺激模式的生成
使用专有软件包创建了由围绕斑马鱼旋转的黑白正弦波光栅组成的刺激模式。通过该软件包，可对波形、对比度、强度、角速度和空间频率进行调节。图案由 VisioTracker 内置的数字光投影仪投射到屏幕上。斑马鱼眼睛与屏幕之间的距离约为 4.5 cm，投影画面在水平方向覆盖 360 度，垂直方向覆盖 55 度。对于幼鱼，以 0.33 Hz 的频率改变刺激方向，以减少扫视频率。成年鱼则采用单向刺激，且仅分析颞侧向鼻侧方向刺激的眼动数据，因为鼻侧向颞侧的眼动速度通常显著较低且不够稳定（参见 Mueller 和 Neuhauss，2010 年）。
- 眼动记录
将鱼头部的明场图像输入红外摄像机。鱼体的红外照明从下方实现。摄像机分别以每秒5帧（幼体）或每秒12.5帧（成体）的速率记录图像。图像会自动进行处理，对眼球形状进行校正和平滑。随后，专用软件自动确定眼球相对于水平轴的方向，并计算眼球运动速度。软件还会自动校正鱼体的微小移动。所有记录和分析均实时完成。
3. 实验后数据处理
- 对眼动速度的原始测量数据进行扫视过滤，以提取慢相速度。
- 采用7帧滑动窗口的滑动平均法对去除扫视后的眼动速度曲线进行平滑处理。
- 在相同刺激条件下对多帧数据的眼动速度进行平均。
- 对于幼鱼，双眼的眼动速度取平均值。
4. 代表性结果：
为了评估VisioTracker在幼鱼和成鱼中的检测能力，实验使用了5日龄的斑马鱼幼鱼和成年斑马鱼进行。
对于幼体斑马鱼， 保险杠 选择该突变体。在此突变体中，晶状体上皮细胞过度增殖，导致晶状体尺寸减小及晶状体异位。这些形态学改变表现为对比敏感度和视力显著下降（Schonthaler 等，2010）。图1展示了突变体bumper与其野生型同胞在对比敏感度上的差异。 缓冲器 随着刺激对比度降低，突变体调节眼动速度的能力逐渐下降。类似地，当刺激的空间频率增加时，即刺激条纹宽度减小时， 保险杠 突变体同样表现出视觉敏锐度降低（图 2）
通过将成年斑马鱼置于不同浓度的酒精水环境中30分钟，随后在不同刺激条件下测量其视动反应，研究了环境条件对成年斑马鱼视觉功能的影响。当酒精浓度逐渐升高时，成年斑马鱼的对比敏感度显著降低（图3）。当斑马鱼暴露于逐渐升高的酒精浓度中时，在广泛的空間频率范围内，其整体眼动速度也呈现出类似的剂量依赖性下降（图4）。此外，随着任务难度增加（例如刺激速度提高），酒精处理以剂量依赖方式进一步降低眼动功能表现（图5）。
图1. 斑马鱼幼体的眼动速度依赖于刺激对比度。在5 dpf时，分析了10只bumper突变体和10只野生型兄弟个体在不同刺激条纹对比度条件下的表现。图表显示平均眼动速度 ± 1 SEM。
图2. 斑马鱼幼体的眼动速度依赖于空间频率。在5天龄时，对10只bumper突变体和10只野生型同胞个体施加不同宽度的刺激条纹，并按所述方法进行分析。图中显示平均眼动速度 ± 1 SEM。
图 3. 成年斑马鱼表现出酒精浓度依赖性的对比敏感度下降。成年斑马鱼在不同浓度的酒精中维持30分钟，随后在不同刺激条纹对比度条件下进行分析。该图显示了每组9条鱼（对照组除外，n=11）的颞侧至鼻侧眼动速度平均值 ± 1 SEM。
图 4. 成年斑马鱼在不同宽度刺激条纹条件下，表现出随酒精浓度升高而整体眼动减少的现象。成年斑马鱼在不同浓度乙醇中处理30分钟，随后在不同刺激条纹宽度条件下进行分析。图中显示每组9条鱼（对照组：n=11）鼻侧至颞侧眼动速度的平均值 ± 1 SEM。
图 5. 成年斑马鱼在不同乙醇浓度处理下，其整体眼动幅度随刺激速度范围的增加而呈现浓度依赖性降低。成年斑马鱼在不同浓度乙醇中维持30分钟，随后在不同刺激速度条件下进行分析。该图显示了每组9条鱼（对照组：n=11）鼻侧至颞侧眼动速度的平均值±1倍标准误（SEM）。
讨论
视动反应（OKR）在视觉功能研究中的重要性早已被科学界所公认（Easter & Nicola 1996, 1997），而对这一范式进行真正量化的工作早在十多年前便已开始。Easter 和 Nicola（1996）开发了一种使用电机驱动的条纹滚筒的系统，通过人工分析眼动的录像。该系统因缺乏对鱼胚胎的有效固定，需频繁手动重新定位，且极难检测到眼球的追踪运动。进一步的改进是采用视频投影的条纹滚筒，从而实现更灵活的计算机生成刺激呈现（Roeser & Baier, 2003；Rinner et al., 2005a）。
对录像记录进行主要依赖人工、逐帧分析的方法已被证明极为耗时，且在一定程度上受到观察者偏倚的限制（Beck et al., 2004）。实时自动化分析被提出，可用于行为反馈学习机制的研究（Major et al., 2004）。Beck et al.（2004）率先采用了红外照明和频率控制的旋转刺激装置。然而，该系统仅用于幼虫，且分析为离线进行。此外，VisioTracker 可实现对刺激的完全控制，包括在实验过程中动态更改刺激，从而提供更高的灵活性，并可对实验进程进行即时干预。同时，VisioTracker 采用的数字刺激生成方式，克服了此前使用条纹刺激鼓时因惯性质量加速所带来的问题（Beck et al., 2004）。
甲基纤维素固定幼鱼不会显著干扰其眼动，且对斑马鱼的健康无任何长期影响。斑马鱼幼体成功地在甲基纤维素中嵌入培养数天，直至随着年龄增长，通过皮肤供氧无法满足其代谢需求（Qian et al., 2005）。
成年鱼类的固定方法对动物同样温和。实验时间短，且可快速更换测试鱼类，进一步提升了该系统的动物福利优势。由于鱼鳃持续受到水流冲洗，因此可方便地向水中添加任何选定的化学物质，以研究其对眼动和视觉功能的影响。类似地，在实验之间无需对动物进行操作，即可直接增加一个洗脱实验。
通过专有的 VisioTracker 软件中的平滑算法，视频图像中的像素噪声被降至最低，从而实现了对眼位和角速度的高精度测量。此外，为了便于统计分析，该软件滤除了以恒定速度发生的扫视运动，这些运动对实验结论并无贡献。对7个视频帧的速度曲线进行平均处理，有助于后续分析。
VisioTracker 为众多不同的研究领域开辟了新的维度。该系统及其前身已被成功用于量化斑马鱼幼鱼的视觉功能，所采用的参数包括视敏度、对比敏感度和光适应能力（Rinner 等., 2005a; Schonthaler 等., 2010），也可用于在调控视觉信号转导级联中的成员后，对视锥光感受器进行功能分析（例如 Rinner 等., 2005b; Renninger 等., 2011），或用于分析突变型斑马鱼幼鱼的视觉缺陷（例如 Schonthaler 等., 2005, 2008；Bahadori 等., 2006）。通过记录眼动反应（OKR）的方法，研究人员已探究了视觉系统形态发育与功能成熟之间的相互依赖关系，结果表明，在幼鱼阶段，视敏度主要但并非完全受限于光感受器之间的间距（Haug 等., 2010）。
VisioTracker 同样适用于分析成年斑马鱼及其他体型相似的鱼类物种的视觉功能（Mueller 和 Neuhauss（2010），本报告）。
也可以将该系统应用于毒理学或药理学等研究领域，通过向包围成年斑马鱼鳃部的水流中添加待研究的物质来进行实验。此外，VisioTracker 系统具有高度的多功能性，可实现对视觉功能的个体发育、神经环路功能及其发育过程或感觉运动控制等更深入的分析（参见 Huang 与 Neuhauss，2008 年的综述）。
披露
Oliver D.R. Schnaedelbach 和 Holger D. Russig 是 TSE Systems GmbH 的员工，该公司生产本文所使用的视觉性能追踪系统。本文的制作由 TSE Systems GmbH 赞助。Stephan C.F. Neuhuass 是苏黎世大学的员工，该大学因每售出一套系统而从 TSE Systems 获得报酬。
致谢
KPM 受欧盟第七框架计划（RETICIRC）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222） | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm 细胞培养皿 | Corning | 430165 | |
| 血清移液管 | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
参考文献
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