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利用光声流式技术检测与分离循环黑色素瘤细胞

DOI：

10.3791/3559

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2011年11月25日

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1Biological Engineering, Christopher S. Bond Life Sciences Center, Dermatology, University of Missouri

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种利用激光诱导超声检测循环黑色素瘤细胞的流式细胞仪，用于作为转移性疾病早期的指示指标。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

循环肿瘤细胞（CTCs）是指从原发性肿瘤脱落，通过血液和淋巴系统扩散并形成继发性肿瘤的细胞。1,2,3循环肿瘤细胞（CTCs）是转移性疾病的指标，其在血液样本中的检测可用于癌症的诊断及患者病情的监测′s 对治疗的反应。由于循环肿瘤细胞（CTCs）极为稀少，在晚期癌症患者中，大约每数十亿个正常血细胞中仅含有一个肿瘤细胞，因此其检测与计数十分困难。我们利用大多数黑色素瘤细胞含有色素的特性，在定制的流式细胞仪中通过光声效应（即激光诱导的超声波）来检测循环黑色素瘤细胞（CMCs）。4,5该过程包括通过离心分离全血样本并获取白细胞层。若循环微核细胞（CMCs）存在于全血中，由于其密度与白细胞相近，将随白细胞一同分离。将这些细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并注入流式检测装置。我们并未采用血液细胞悬液的连续流动方式，而是引入两相流，以捕获这些细胞用于后续研究。在两相流中，两种互不相溶的液体在微流控系统的交汇处相遇，形成交替的液段。6,7PBS悬浮的白细胞与空气形成微升级的液段，依次受到激光照射。在液相中加入表面活性剂可实现均匀的液段形成，用户可通过调节两相的流速来生成不同大小的液段。空气液段以及含有白细胞的PBS液段不含光吸收剂，因此不产生光声波。然而，含有单个循环微小癌细胞（CMC）的白细胞液段可吸收激光并产生高频声波。这些能够产生光声波的液段被分离并收集，用于后续的细胞化学染色以确认CMCs的存在。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 血液样本制备

  1. 从IV期癌症患者体内抽取约10 mL全血，分装至两支5 mL真空采血管中。
  2. 将离心管在3,000转/分钟（rpm）下离心10分钟。
  3. 血液样本将分为三层：底层为红细胞，中间层也称为白膜层， 血沉棕黄层 涂层含有白细胞和黑色素瘤细胞，顶层含有血浆和血小板。尽可能去除血浆，但不要扰动白细胞层。
  4. 放置 250 μL 两支1 mL温特罗伯管中各加入1 mL Histopaque 1077。
  5. 使用9″巴斯德吸管，吸取剩余的血浆、全部的白膜层，甚至红细胞的顶层，确保收集完全 < 500 μL.
  6. 将溶液置于Histopaque层上方，将Wintrobe管放入15 mL离心管中，在3000 rpm条件下离心10分钟。
  7. 血液将再次分层，但此次红细胞会被Histopaque分离，从而便于提取血沉棕黄层。使用9英寸巴斯德吸管吸取全部血沉棕黄层，并转移至一个2 mL离心管中。
  8. 将血沉棕黄层重悬于含有 2% v/v Tween 20 的 1.5 mL PBS 中。

2. 流动腔室的构建

  1. 取一个丙烯酸圆柱体，外径 20 mm，内径 17 mm，高 8 mm。在圆柱体侧面相互成 90 度角的位置钻三个直径为 5 mm 的孔。截取三段聚合物管（内径 1.6 mm，外径 5 mm），插入钻好的孔中。
  2. 将 Parafilm 封装在丙烯酸环的底部，形成防水密封。Parafilm 与丙烯酸环构成一个浅碗状结构，用于容纳丙烯酰胺溶液，从而形成流动室。
  3. 将一根直径为 1.6 mm 的金属丝穿过相对放置的两段聚合物管，确保仅金属丝本身从环的中央可见。在第三段聚合物管中插入同样直径为 1.6 mm 的金属丝，并将其定位在距离悬挂金属丝 1 mm 的位置。这些金属丝可防止丙烯酰胺进入管道。待丙烯酰胺固化后，抽出金属丝，留下一个圆柱形的流道，以及用于放置聚焦于流道的光纤的位置。
  4. 将 5 mL 配制好的丙烯酰胺溶液 [20 g 丙烯酰胺（Sigma Aldrich），0.7 g 双丙烯酰胺（Sigma Aldrich），100 mL 蒸馏水] 加入小烧杯中。称取 0.02 g 过硫酸铵（Sigma），加入烧杯中。用磁力搅拌器搅拌 3 分钟。向烧杯中加入 20 μL 四甲基乙二胺（Fisher Scientific）。迅速将混合液倒入丙烯酸环中，直至充满顶部。数秒后，溶液将凝胶化，形成流动室模具。小心抽出金属丝，注意不要扰动丙烯酰胺凝胶。流动室现已准备就绪，可供使用。

3. 光声流式测量装置的设置

  1. 使用超声耦合剂将聚偏氟乙烯压电声学换能器（Panametrics）在流动腔室的流道正上方进行声学耦合。
  2. 使用卡口式尼尔-康西尔曼（BNC）电缆将换能器连接至 RITEC Broadband Receiver-640A 的输入端（低通滤波器：关闭，高通滤波器：1 MHz，输入阻抗：50 Ohms，放大倍数：35 dB）。将滤波器的输出端连接至示波器（Tektronix TDS 2024B）。为触发示波器，将一个光电二极管（Thorlabs）放置在换能器附近，并通过 BNC 电缆接入示波器。
  3. 将一个三通接头（Small Parts）连接至流动腔室的一端。另两个支路分别连接两台注射泵（Braintree Scientific）。其中一个注射器内含空气，另一个则装有第1部分制备的细胞悬液。设定流速为 100 μL/分钟。
  4. 抽出流动腔室的细管，直至形成一个小的气囊，并将一根直径为 1 mm、数值孔径为 0.37 的芯光学纤维插入该气囊中。向气囊内注水以减少界面信号并增加照射到流道的激光光量。由于光学纤维的数值孔径较大且距离流道较近，激光在任意时刻仅照射一个样品液段，确保位于激光前方的样品即为产生光声信号的样品。激光能量应约为 28 mJ/cm2，光斑面积为 7 mm2。
  5. 启动两台注射泵。当两种不相溶的流体到达三通连接处时，会形成均一的液段并流经换能器。
  6. 使用纳秒脉冲激光照射流动的样品，以在黑色素瘤细胞中产生光声波。由于黑色素是一种宽谱光学吸收体，可使用任意可见光波长的激光。
  7. 当液段流经换能器并在示波器上出现信号时，表明该液段中含有黑色素瘤细胞，应追踪其在系统中的流动路径，直至落入收集管中。

4. 免疫细胞化学

  1. 将捕获的细胞转移至 Cytospin 4 离心机（Thermo Scientific）中，以固定于玻片上。将玻片放入 Cytofunnel（Shandon EZ Single Cytofunnel with Brown Filter Card Thermo Scientific）中，并装载到 Cytospin 4 离心机内。向每个 funnel 中加入 100 μL 含 1% 牛血清白蛋白（Sigma）的 PBS 溶液，然后以 600 rpm 离心 3 分钟，以促进捕获的细胞粘附于玻片表面。
  2. 离心后，将细胞样本加入 Cytofunnel 中，再以 600 rpm 离心 3 分钟。随后用基于乙醇的固定剂喷洒玻片。
  3. 用 PBS 洗涤玻片，每次 10 分钟，重复两次。
  4. 为阻断非特异性结合，每张玻片加入由 10 μL 正常山羊血清（Sigma）与 90 μL PBS 配制的混合液，在室温下孵育 1 小时。
  5. 孵育结束后，倾去液体，将玻片置于湿盒中，加入一抗溶液，在室温下孵育 1 小时。每张玻片所用一抗溶液包含：1% 兔源 MART-1 抗体、1% 小鼠源 CD-45 抗体、10% 山羊血清和 89% PBS。
  6. 孵育后，用 PBS 洗涤玻片，每次 10 分钟，共洗涤三次。
  7. 随后将玻片置于含荧光染料标记的二抗溶液中孵育。该溶液包含：0.05% 山羊抗兔抗体、0.05% 山羊抗小鼠抗体、0.1% 山羊血清和 99% PBS。在室温下避光孵育 1 小时。
  8. 孵育结束后，倾去液体，用 PBS 洗涤 5 分钟，重复三次。
  9. 为进行细胞核染色，加入终浓度为 0.1 μg/mL 的 DAPI（Invitrogen）溶液，孵育 1 分钟。随后倾去液体，并用 PBS 洗涤。
  10. 每张玻片加入 20 μL 树脂封片介质，覆盖盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片边缘以保存样本。此时玻片已准备好用于荧光显微镜成像。

5. 代表性结果：

细胞成像与电信号图；白细胞、黑色素瘤细胞；显微镜检查、电压表。
图 1. 此处显示了来自白细胞和黑色素瘤细胞的光声波形。由于白细胞本身无色素，不产生光声波，表现为一条电子噪声的平坦直线（左）。而含色素的黑色素瘤细胞则产生明显的光声波信号（右）。

染色细胞的荧光显微镜图像；蓝色为细胞核，绿色为细胞质分析。
图 2. 免疫细胞化学染色后，培养的黑色素瘤细胞显示蓝色的 DAPI 信号，而 MART1 以绿色突出显示。

荧光显微镜图像；细胞染色；蛋白质定位；免疫应答研究；实验室分析。
图3. 与图2中DAPI和MART1图像叠加类似，本图以CD45作为白细胞标记物，显示在多个白细胞中存在黑色素瘤细胞。

讨论

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由于难以分离出稀有的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞（CTC）的检测目前仍是一个研究密集型领域，临床应用极少。目前已有多种技术正在被评估用于CTC检测，包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、微流控细胞捕获、免疫磁珠捕获及其他方法8-12。然而，循环肿瘤细胞的光声检测展现出良好的应用前景，因其无需标记且能够快速、准确地捕获微小的光吸收颗粒。

用于分离白细胞的方案效率很高，但样本中仍存在少量红细胞。这些混入的污染细胞也会吸收激光，但吸收水平显著降低。为确保红细胞不会干扰我们的黑色素瘤检测系统，将五份健康患者的样本导入系统进行检测，均未产生信号，表明红细胞的浓度已低至可忽略不计。

已使用培养的黑色素瘤细胞进行了一系列浓度研究，光声流式系统已证明对低至1个细胞/μL的浓度具有检测灵敏度（未发表数据）。这些研究正在进行中，不久将包括使用癌症患者样本的试验。

这种光声技术也正在通过连接外源性发色团，评估其在非色素性循环肿瘤细胞（CTC）中的应用，例如乳腺癌和前列腺癌。我们已利用金纳米颗粒对癌细胞开展了初步研究13。这些试验表明，纳米颗粒能够提供产生光声波所需的光学吸收。目前尚存的技术挑战在于如何选择性地将此类颗粒连接到癌细胞上。

披露

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John A. Viator 是 Viator Technologies 公司的创始人兼总裁，该公司致力于将光声技术商业化，以改善人类健康。

致谢

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我们感谢密苏里大学生物工程系和克里斯托弗·S·邦德生命科学中心的支持。本研究获得密苏里生命科学研究委员会（09-1034）和美国国立卫生研究院（NIH R21CA139186-0）资助项目的支持。同时，我们还感谢密苏里大学生命科学本科生研究机会计划、密苏里大学分子细胞学核心实验室以及密苏里大学工程学院提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM英潍捷基ABCD1234

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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