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方法文章

利用固态纳米孔监测蛋白质吸附

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DOI：

10.3791/3560

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2011年12月2日

 , 
1Department of Physics, Syracuse University

本文内容

摘要

本文描述了一种利用固态纳米孔监测蛋白质在无机表面上非特异性吸附的方法。该方法基于电阻脉冲原理，可实现对吸附过程的实时、单分子水平检测。由于单个蛋白质吸附过程远未达到平衡状态，我们建议采用合成纳米孔的并行阵列，从而能够定量测定蛋白质吸附的表观一级反应速率常数以及朗缪尔吸附常数。

摘要

固态纳米孔已被用于在单分子水平上进行测量，以研究核酸的局部结构和柔性1-6、蛋白质的去折叠过程7，以及不同配体的结合亲和力8。通过将这些纳米孔与电阻脉冲技术相结合9-12，可在多种条件下进行此类测量，且无需标记3。在电阻脉冲技术中，纳米孔两侧均引入离子盐溶液，因此在外加跨膜电势的驱动下，离子从腔室的一侧向另一侧移动，形成稳定的电流。当分析物进入纳米孔时，会引起电流发生明确的偏转，通过分析该偏转可获取单分子信息。利用该技术，可在广泛条件下监测单个蛋白质在纳米孔壁上的吸附行为13。蛋白质吸附的重要性日益凸显，因为随着微流控器件尺寸的缩小，这些系统与单个蛋白质之间的相互作用成为需要关注的问题。本实验方案描述了一种快速检测蛋白质与氮化物薄膜结合的分析方法，该方法可轻松扩展至其他适合钻孔的薄膜材料，或功能化的氮化物表面。可在多种溶液环境和变性条件下研究多种蛋白质。此外，该方案也可用于通过纳米孔光谱学探索更基础的科学问题。

方案

1. 在氮化硅薄膜中制备固态纳米孔

  1. 将 FEI Tecnai F20 S/TEM 的加速电压调节至 200 kV。若使用其他 S/TEM，加速电压应大于或等于 200 kV 9
  2. 将一个厚度为 20 nm 的 SPI 氮化硅窗格栅载入透射电镜样品 holder，并用氧气等离子体清洗 30 秒，以去除 holder 上的任何污染物。
  3. 将样品载入 S/TEM，并使真空系统抽至工作真空度。当 S/TEM 达到真空状态后，在明场 TEM 模式下通过寻找 Ronchigram 上的明亮方块来定位氮化硅窗区。确保 TEM 已正确对中，然后对样品进行对中和聚焦。
  4. 将 S/TEM 切换至 STEM 模式。使用 HAADF（或等效）探测器对样品成像，并确保其正确对中。
  5. 将单色器设置为较低值。单色器值越低，可用于钻孔的电子束流越高。若 S/TEM 未配备单色器，可忽略此步骤。
  6. 选择合适的钻孔束斑尺寸。该参数对应于电子探针的直径。3 nm 的探针适用于钻制直径为 5 nm 的纳米孔。较大的探针（5 nm）钻孔速度更快，且形成的孔更大；较小的探针（1 nm）钻孔所需时间更长，形成的孔也更小。
  7. 如有必要，调整 STEM 的对中参数。
  8. 对氮化硅薄膜进行聚焦，并将其放大倍数调至 ×1.3M。精细聚焦应通过监测 Ronchigram 来完成。
  9. 若样品存在任何移动，则需等待样品稳定。此过程可能长达一小时。等待期间应关闭电子束，以免损伤氮化硅薄膜。
  10. 将电子探针定位至样品上，开始钻孔。
  11. 定期使用 HAADF 探测器扫描样品，以检查钻孔进展（纳米孔将呈现为暗斑），并确认样品无漂移。若样品发生轻微漂移，应调整电子探针位置，使其重新对准纳米孔中心。
  12. 观察 Ronchigram 以判断纳米孔是否形成。当处于聚焦状态时，氮化硅薄膜呈现闪烁的外观；纳米孔形成后，该特征将消失。将 Ronchigram 略微调至离焦状态，可观察到与纳米孔相关的菲涅耳环。
  13. 使用 HAADF 对纳米孔成像。
  14. 对纳米孔图像进行强度轮廓分析。纳米孔的直径可通过轮廓中最暗区域进行估算。
  15. 可通过将电子探针沿孔边缘移动，进一步扩大纳米孔尺寸。
  16. 当纳米孔达到目标直径后，将 S/TEM 切换回 TEM 模式。
  17. 将单色器恢复至标准设置，并在明场 TEM 模式下对纳米孔成像以确认其尺寸 (图 1)。

2. 固态纳米孔的润湿

  1. 对含有 1 M KCl、10 mM 磷酸钾（pH 7.4）的去离子水进行脱气处理。可通过将溶液置于真空环境中，并在超声波清洗仪中处理 20 分钟来实现。
  2. 将含有纳米孔的氮化硅芯片放入一个 10 ml 的派热克斯（Pyrex）烧杯中。注意避免损坏氮化硅窗口，因其非常脆弱。将烧杯置于通风橱内的加热板上，并设定温度为 100°C。
  3. 小心使用食人鱼溶液（piranha solution）清洗纳米孔芯片。首先使用玻璃移液管向容器中加入 3 ml 浓硫酸。然后，小心地将 1 ml 过氧化氢加入浓硫酸中以配制食人鱼溶液14。请采取一切必要的安全防护措施。
  4. 让纳米孔芯片在食人鱼溶液中浸泡 10 分钟。
  5. 使用玻璃移液管将食人鱼溶液从烧杯中移除，并将其放入适当的储存容器中。
  6. 使用洁净的玻璃移液管将脱气后的去离子水加入烧杯中，随后倒掉水，重复此冲洗步骤至少 5 次。
  7. 使用洁净镊子取出纳米孔芯片，并通过轻微抽吸的方式将其干燥。
  8. 立即把纳米孔芯片密封到测量室中 (图 2a, 2b)。可通过 O 型圈或硅胶密封剂将芯片固定在测量室内。
  9. 向测量室中加入 KCl 溶液。
  10. 将 Ag/AgCl 电极连接至测量室 (图 2b)。电极可通过将银丝浸泡在漂白剂中过夜制备。
  11. 在电极之间施加跨膜电势，并使用 Axon 200B 膜片钳放大器在电压钳模式下监测电流响应。
  12. 根据测量结果绘制 I/V（电流-电压）曲线。当使用 1 M KCl 时，I/V 曲线应呈现高度线性 (图 3)。纳米孔的电导应与其直径相对应。若纳米孔未表现出线性 I/V 曲线、电导过低，或纳米孔的开路电流不稳定 (图 4a)，则表明纳米孔未充分润湿，需重复食人鱼溶液清洗步骤。

3. 监测蛋白质吸附

  1. 进行对照实验时，必须使用单纳米孔膜或纳米孔平行阵列（见下文），以监测在不含蛋白质样品的缓冲液条件下产生的电流。我们建议采取以下两个步骤：(i) 使用高纯度缓冲液（纯度 > 99.9%；色谱级），以及 (ii) 使用不会与固态纳米孔相互作用而产生单通道事件的缓冲液。此外，建议采用标准的蛋白质化学方法获得高纯度的蛋白质样品。应通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶分析和高分辨率质谱法来检测蛋白质样品的纯度15。
  2. 将待研究的纯化蛋白质样品加入到腔室的接地侧溶液中。给予足够时间使样品在溶液中充分扩散。通常可检测的蛋白质浓度范围为数十 nM 至 μM7,15-21。
  3. 施加跨膜电位偏压，其极性应与所研究蛋白质的总电荷相反。例如，牛血清白蛋白（BSA）在 pH 7.4 时具有有效的净负电荷，因此应施加正向电压偏压。所施加的电压会在纳米孔内部形成电势梯度，带相反电荷的蛋白质将受到相反方向的驱动力。只有将蛋白质驱入纳米孔的电压极性才能产生可测量的信号。
  4. 施加 200 mV 幅值的电位通常足以观察大多数蛋白质分析物。事件将表现为相对于基线的瞬时电流偏移（图 4b）。若未观察到信号，可提高腔室中蛋白质的浓度。较高的电压可改善信噪比。氮化物纳米孔可耐受数伏电压。
  5. 蛋白质吸附将表现为纳米孔基线电流的长时程变化（图 4c）。

4. 纳米孔功能化的可能性

目前存在多种将官能团引入氮化硅的方法22,23。大多数氮化物薄膜表面具有一层薄氧化层，必要时可通过臭氧处理形成额外的氧化层。不同的有机硅烷可在该氧化层上进行自组装。其中特别值得关注的是氨基硅烷，它能够自组装并进一步修饰（例如引入羧酸基团或醛基），从而实现对多种有机表面的研究。在纳米孔经piranha溶液清洗并固定于测量腔室后，可将氨基化合物直接加入含有0.5 M TBACl（四丁基氯化铵）作为支持电解质的腔室溶液中，并以无水甲醇（MeOH）作为溶剂。单分子层的形成可通过施加400 mV电压偏置并监测电流下降来进行表征23。

5. 利用平行纳米孔阵列测定表观一级反应速率常数和朗缪尔吸附常数

5.1 吸收与解吸的表观一级反应速率常数

我们强调，该方法的积极方面在于其能够在单分子水平上观测单个吸附事件。通过采用固态纳米孔的并行阵列，可实现对蛋白质在无机表面上单分子吸附的高通量测量。由于需要检测大量纳米孔以获得可靠的统计结果，因此必须使用纳米孔阵列。采用纳米孔阵列可同时监测单个吸附事件，并记录多个事件以供后续分析。通过上述方案，只需在样品上钻出多个孔洞，即可在氮化硅材料中形成纳米孔阵列。每个纳米孔的尺寸应大致相同。6×6 或 7×7 的纳米孔阵列通常已足够。当向腔室中加入蛋白质分析物后，电流将按以下指数形式衰减：

It = I∞ - (I∞ - I0)exp(-k't)

此处， It，表示实验时间点的电流 t. I0 是穿过纳米孔阵列的原始电流。 I∞ 表示饱和状态下的电流（即无穷大时的电流）。 k为表观一级反应速率常数，可通过实验曲线拟合确定。较大的 k可解释为吸附速率更快。该比率 I∞/I0，也称为归一化饱和电流，是一个介于0和1之间的无量纲数值。该参数用于衡量吸附蛋白分析物的占据程度。因此，每种不同的实验条件都应对应两个特定的输出参数 I∞/I0 和 k'。

需要注意的是，表观一级吸附速率常数和归一化电流受到蛋白质在纳米孔内停留有效时间的影响。该时间取决于体相水溶液中蛋白质分析物的浓度24。因此，需要根据蛋白质在纳米孔内部停留的有效时间对这些数值进行额外校正。我们建议测量快速（易位）事件的发生频率，并将其乘以此类事件的平均停留时间，从而得到单位时间内蛋白质在纳米孔内部的平均停留时间。

脱附速率常数也可以利用纳米孔的平行阵列来测定。一旦电流水平达到饱和（I∞），应立即反转电压，以防止更多蛋白质被捕获进入纳米孔。单个蛋白质的脱附过程将伴随着记录电流向更高值的变化。脱附速率常数将由此电流水平的上升过程提取得出。

5.2 朗缪尔吸附常数

蛋白质分析物在纳米孔无机表面的吸附程度取决于水相中蛋白质的浓度。这一现象已在单分子水平上被观察到13。若以 θ 表示归一化的饱和电流（I∞ / I0），则典型的朗格缪尔等温方程可由以下表达式给出：

朗缪尔吸附等温方程 θ=αC/(1+αC)；吸附分析；科学研究中的公式。

其中 C 为水相中的蛋白质浓度，α 为朗格缪尔吸附常数。该常数随吸附结合能的增大而增大，并随温度的降低而增大。收集 θ 数据点时，需在水相中不同蛋白质浓度下进行平行阵列实验测量。应对数据结合其他技术进行分析，以验证拟合所得朗格缪尔吸附常数的量级。此外，全原子分子动力学模拟25,26也可用于辅助解释所获得的实验数据。

6. 代表性结果

固态纳米孔的典型实验结果如下。开孔电流应高度稳定，如图4a所示。在1 M KCl、10 mM磷酸钾、pH 7.4条件下，纳米孔的电流-电压（I/V）特性应呈现高度线性，如图2所示。对I/V曲线进行线性拟合所得斜率即为纳米孔的单通道电导。电导值与纳米孔直径直接相关，并应符合以下公式：静态平衡方程 G≈(πd²/4l)σ；承载能力公式；力学应力分析。，其中G为纳米孔的电导，d为其直径，l为其长度，σ为溶液室中溶液的电导率14。该计算值应在实测值的30%范围内相符。若偏差过大，则表明纳米孔可能未充分润湿。加入蛋白质后，应出现快速的电流阻断事件，如图4b所示。蛋白质吸附表现为长时间的电流下降，如图4c所示。某些蛋白质结构不稳定，会在纳米孔内部发生构象转变，此时长时间的电流下降将伴随快速的电流波动。

透射电镜图像中的纳米颗粒；10 nm 尺度；显微分析；材料科学研究。
图 1. 使用 Tecnai F20 S/TEM 制备的固态纳米孔。该孔在 STEM 模式下钻取，直径为 20 nm。图像在明场 TEM 模式下拍摄。氮化物厚度为 30 nm。

用于溶液测量实验的透射电镜载网和O形圈装置示意图，标注了各组件。
图 2. 用于容纳单个固态纳米孔以进行电阻脉冲测量的装置。 A) 装置及带有自支撑氮化物窗口（透射电镜载网）的硅芯片。纳米孔在加载前已钻入氮化物膜中。红色O形圈用于在芯片周围形成良好密封，使两侧的离子溶液浴相互隔离。B) 装置示意图，显示了相对于纳米孔的溶液浴和电极的布置位置。

电流-电压图；纳米材料表征；电阻分析；线图
图 3. 不同直径固态纳米孔的典型电流-电压（I/V）曲线。 单通道电学信号在 1 M KCl、20 mM Tris、pH 8.5 条件下测得。纳米孔制备于 30 nm 厚的氮化硅薄膜上。需注意，氮化硅的厚度会影响纳米孔的单通道电导。

离子通道活性图：显示三种实验条件下电流（pA）随时间（10秒）的变化。
图4. 单通道电流记录及蛋白质吸附的检测。 A) 显示直径为10 nm的纳米孔开放电流的单通道电学记录。B) 电流偏转代表牛血清白蛋白（BSA）进入纳米孔内部。C) BSA在氮化物表面的吸附。所有记录均来自同一纳米孔，在1 M KCl、10 mM磷酸钾、pH 7.4条件下获得。施加的跨膜电势为+40 mV，BSA以120 nM浓度加入接地侧腔室浴液中。

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讨论

蛋白质在固相表面的自发吸附27-29在多个领域中具有根本性的重要意义，例如生物芯片应用以及一类新型功能化杂合生物材料的设计。先前的研究表明，吸附在固相表面上的蛋白质不表现出侧向迁移能力或显著的脱附速率，因此通常认为蛋白质吸附是一个不可逆且非特异性的过程30-32。人们认为，蛋白质在固相表面的吸附是由多种因素引起的，包括蛋白质侧链与固-液界面反应基团之间的静电作用力和疏水作用力等13。

蛋白质吸附过程已通过多种方法进行研究，例如石英晶体微天平28,29、电子显微镜33,34、椭圆偏振法35、荧光标记36以及平面偏振干涉法（PPI）37。相比之下，这种单纳米孔及纳米孔阵列方法依赖于单个蛋白质分析物与纳米孔内部相互作用所引起的可检测的单通道电流变化。

获得阳性结果最关键的一步是纳米孔内部的充分润湿。如果纳米孔的特性未达到结果部分所述的指标，可采用多种故障...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

作者谨感谢康奈尔大学的 John Grazul、不列颠哥伦比亚大学（温哥华）的 Andre Marziali 以及渥太华大学的 Vincent Tabard-Cossa 提供的建议。本工作部分由美国国家科学基金会（DMR-0706517 和 DMR-1006332）以及美国国立卫生研究院（R01-GM088403）的资助支持。纳米孔钻孔实验在康奈尔材料研究中心（CCMR）电子显微镜设施完成，该设施得到了美国国家科学基金会材料研究科学与工程中心（MRSEC）项目（DMR 0520404）的支持。氮化硅膜的制备在康奈尔纳米级设施完成，该设施是美国国家纳米技术基础设施网络的成员，由美国国家科学基金会（ECS-0335765）资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tecnai F20 S/TEMFEIS/TEM 需要加速电压 ≥200kV 并配备场发射光源。
用于透射电镜的 20 nm 厚氮化硅薄膜窗口SPI Supplies4163SN-BA
Axon Axopatch 200B 膜片钳放大器Molecular Devices
Axon Digidata 1440AMolecular Devices
pCLAMP 10 软件Molecular Devices电生理数据采集与分析软件
硫酸菲希尔科技公司（Fisher Scientific）A300
过氧化氢菲希尔科技公司（Fisher Scientific）H325
硅胶 O 型圈McMaster-Carr003 S70也可使用 PDMS
银丝Sigma-Aldrich348759用于电极
SPC Technology，D 型接口，针脚Newark Inc9K4978用于电极
氯化钾Sigma-AldrichP9541
磷酸氢二钾Sigma-AldrichP2222
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5379
PDMSDow CorningSylgar 184 弹性体套装，用于制作腔室。
Kwik-Cast 密封剂世界精密仪器公司（World Precision Instruments, Inc.）KWIK-CAST快速固化的硅胶密封剂
加热板菲希尔科技公司（Fisher Scientific）
法拉第笼

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